RNAi Triagem para Fatores Hospedeiros Envolvidos na Vaccinia Infecção pelo Vírus usando Drosophila Células

Parte 1: RNAi em 384 placas de Bem Padronização dos reagentes utilizados para o rastreio é essencial. Testamos lotes individuais de mídia de Schneider, soro fetal bovino, e reagentes de coloração. Então nós alíquotas e usar o mesmo lote para a tela inteira. Para qualquer ensaio, é melhor testar várias linhas de células diferentes para determinar qual é mais receptivo à sua biológico de leitura. Normalmente usamos a linha S2-NUPAD. Cultivar células Drosophila a 25 ° C nos meios de comunicação Schneider completo. Media Schneider 10% de calor FBS inativada 1X L-glutamina 1X Pen / strep antibióticos Células Drosophila são semi-aderente e são várias passagens sem tripsinização a cada quatro dias por pipetagem as células fora os balões e diluir as células 1:10 em um frasco fresco. As células devem estar em fase de registro para experimentos. Placa-to-plate e dia-a-dia variabilidade são minimizados através do uso de manipulação de líquidos automatizado para todas as adições líquidas de multi-lamelas. Nós usamos um WellMate (Matrix). Prepare tubulação WellMate. Spray de capuz e WellMate com etanol 70%. Remover tubos de embalagem e de pulverização com etanol 70%. Inserir cassete tubulação na dispensação posição no WellMate. Tubulação privilegiada, com 25 mL de etanol 70%. Esterilizar tubulação em etanol por 15 minutos, então primeiro com outro de 25 mL de etanol. Enxágüe tubulação por priming com 50 mL de PBS estéril. Desalojar células do frasco e contagem. Células pelota para que você tenha 25% a mais do que o necessário (300xg, 5 min). O número de células inoculadas por poço deve ser otimizado de acordo com a duração do ensaio. No âmbito da análise automática de imagem, uma monocamada único sem aglomeração celular é ideal para segmentação de imagem. Ressuspender as células peletizada no soro livre de Schneider de mídia em 1.7×10 6 células / mL. Realizamos a tela em 384 placas bem pré-aliquotado com uma biblioteca disponível comercialmente de dsRNA em uma concentração de 250ng/well. Vários poços de cada placa são deixados vazios para controles, que são adicionados manualmente. Usamos a luciferase dsRNA como controle negativo. Usamos dsRNA contra Thread (DIAP) como um controle para robusto RNAi. Derrubar resultados deste anti-apoptóticos fator na morte da célula dramática e é uma maneira rápida e visual para avaliar a qualidade do knock down. Por fim, usamos um dsRNA contra o repórter viral, neste caso galacosidase beta, como um controle positivo para validar que pode inibir a infecção viral com o nosso ensaio de leitura. Se detectar dsRNA em placa no momento da semeadura de células, dsRNA alíquota 1 ml para o canto do bem, para facilitar a visualização, em seguida, centrifugar dsRNA em fundo de poço (300xg, 1 min) antes de adicionar células. Use WellMate para adicionar 10 mL de células preparadas acima para cada poço. Spin-células em placas por centrifugação 300xg, 1 min. Incubar 25 ° C em incubadora por 45 minutos. Adicionar 20 mL completa Schneider de mídia e centrifugar 300xg, 1 min. Placas lugar em recipientes Tupperware umidificado forrado com toalhas de papel embebido em água. O volume de 384 poços é pequena, assim, a evaporação pode ter grandes efeitos sobre a biologia, que por sua vez pode levar a mudanças na artifactual outs leitura dos poços borda. Para superar isso, as placas devem ser mantidos sob alta umidade. Incubar durante três dias para permitir a knockdown robusto. Não há necessidade de alterar a mídia ou abrir recipientes umidificado durante este tempo. Parte 2: Infectando com Vaccinia Virus Esterilizar canal multi-aspirador em Quatricide por 15 minutos, em seguida, lavar em etanol 70%. Prepare WellMate como descrito acima. Prepare media Schneider, com 2% de SFB para a infecção por diluindo completa media 1:05 em soro de mídia livre. Estoque de vírus filtro de crude através de seringa 0,8 hum filtro para remover os restos celulares ou uso de vírus purificado. Diluir vírus vaccinia em 2% de soro Schneider de mídia para obter multiplicidade de infecção (MOI) de 2. Remover PBS a partir de tubos WellMate e privilegiada, com vírus diluído até a tubulação está livre de bolhas de ar. Use esterilizados multi-canal de aspiração e coletor de pó para remover suavemente media das placas de células dsRNA tratados com Drosophila. Dispense 30 mL por poço de vírus em placas usando o WellMate. Centrífuga placas de 1 minuto a 300xg. Esterilizar tubulação WellMate. Prime com 25 mL de blea 10%ch, aguarde 10 minutos, e privilegiada, com outra água sanitária de 25 mL de 10%. Tubulação Prime com 50 mL de água seguida de 50 mL de etanol a 70%. Retorno tubulação para sua embalagem. Retorno placas para recipiente Tupperware umidificado. Incubar a 25 ° C por 48 horas. Parte 3: Placas de coloração Fixar placas em 15 mL de formaldeído 4% / PBS por 10 minutos. Líquido é removido usando um aspirador multi-canal e distribuidor de vácuo em cada etapa. Uma vez que as placas foram fixadas, equipamentos esterilizados e os reagentes não são mais necessárias. Remover corrigir e use WellMate para adicionar 30 mL PBST (PBS + 0,1% Triton-X). Incubar 10 minutos e repita. WellMate operar como descrito acima, exceto tubos não precisam ser esterilizados. Para detectar a infecção vaccinia usamos um repórter β-galactosidase dirigido por um promotor vaccinia cedo / tarde. Remover as células líquido e incubar em bloco (PBST com BSA 2%) por 10 minutos. Diluir o anticorpo primário em bloco, remover o líquido e adicionar 15 mL de anticorpos para cada um pipetador de repetição bem usando uma multi-canal (Matrix). Spin down placas (300xg, 1 min), cubra com um adesivo claro, e incubar a 4 ° C durante a noite. Remover o anticorpo primário, e usar o WellMate para lavar poços em PBST 3 vezes, 10 minutos cada. Diluir fluorescente etiquetado anticorpo secundário (FITC) e nuclear mancha em bloco, e adicionar 15 mL de poços usando um multi-canal de pipetador de repetição. Incubar as placas de uma hora à temperatura ambiente, protegido da luz. Lavar os poços no PBST 3 vezes, 10 minutos cada um usando o WellMate. Seal placa com adesivo transparente, capa, e armazenar a 4 ° C até três semanas. Parte 4: Imagem e Análise de Imagem Use um microscópio automatizado com ampliação de 20x para placas de imagem. Capturar imagens de núcleos total (DAPI) e as células infectadas (FITC). Otimizar o tempo de exposição para cada canal, individualmente, a fim de maximizar o alcance dinâmico. Ajustar a função de foco automático, tendo uma pilha de imagens Z, 1um espaçadas, que abrangem os aviões acima e abaixo do plano previsto de foco. Assim que o avião ideal focal está localizado, ajustar as configurações de focagem automática em conformidade. Imagem da placa inteira, captura de pelo menos três imagens por bem, tanto no canal de Hoechst (DAPI) e do canal de vírus (FITC). Escolha sites de várias regiões diferentes dentro de um poço, a fim de capturar imagens que representam o bem como um todo. Use MetaXpress software para escrever um diário para o segmento de imagem e usar módulos Núcleos Contar para calcular o número total de células positivas para a coloração nuclear (células total) e infecção (FITC) para cada prato. Calcular a infecção por cento (100 células * FITC positivo / total) e log transformar. Para identificar os candidatos que usamos uma pontuação Z robusto baseado na mediana e intervalo interquartil de cada prato. Este método é insensível a outliers e dados não simétrica, proporcionando assim maior poder na identificação ainda bate fraca ou moderada 10. Para cada placa, a mediana é subtraído os dados log-transformados. Em seguida, os valores resultantes são divididos por 0,74 vezes o intervalo interquartil (diferença entre os valores do percentil 75 eo percentil 25). O fator 0,74 é utilizado para aproximar uma distribuição normal padrão. A pontuação Z robusta é uma medida de distância em desvios-padrão da mediana da placa. Por exemplo, um robusto Z-score de 2 indica a infecção% do poço é de aproximadamente 2 desvios-padrão da mediana placa ou p <0,05. Analisar o número de células para identificar candidatos citotóxicos. Calcular o escore Z robusta de contagens nuclear. Candidatos com um robusto Z <-2 em telas duplicadas são considerados citotóxicos. Poços que têm uma pontuação Z robusta para a infecção por cento dos> 2 ou <-2 em telas duplicados (p <0,0025), sem citotoxicidade são considerados candidatos potenciais a partir do ecrã principal. Candidatos positivos são validados usando reagentes independentes. dsRNAs são gerados contra os genes de interesse de outra região do mRNA e testado como descrito acima. Os genes para os quais duas dsRNAs independentes têm o mesmo fenótipo podem ser considerados para um estudo mais aprofundado. Parte 5: Imagens Representante e Interpretação das taxas de infecção Figura 1. Poços não infectadas não apresentam qualquer coloração para proteínas do vírus vaccinia, enquanto um representante infectados poço contém células coloração positiva para vaccinia-expressa a proteína beta-galactosidase (βgal), medido por microscopia de imunofluorescência.Virus = verde, núcleos = blue. Figura 2. Software de análise automatizada de imagem quantifica infecção em cada imagem usando parâmetros definidos pelo usuário. Em uma imagem representativa, o número total de núcleos celulares eo número de células que expressam o antígeno viral são contados com base no tamanho e da intensidade da coloração acima da coloração de fundo local. Figura 3. Knockdown de thread (DIAP) serve como um controle positivo para o esgotamento RNAi robusto de genes-alvo. Knockdown deste fator anti-apoptótico leva à morte celular dramático. Núcleos = blue. Figura 4. Knockdown da luciferase serve como um controle negativo para o efeito de double-stranded RNA tratamento sobre a infecção. Esgotamento de luciferase não tem nenhum efeito sobre a infecção em relação às células não tratadas. Virus = verde, núcleos = blue. Figura 5. Knockdown de proteína βgal serve como um controle positivo para a redução da infecção, já que o ensaio utiliza níveis de proteína βgal como uma leitura de infecção. Esgotamento dos resultados βgal em uma diminuição na porcentagem de células infectadas. Virus = verde, núcleos = blue. Figura 6. Knockdown de celulares fator Rab5 resulta em uma diminuição da percentagem de células infectadas. Desde Rab5 é conhecido por participar de endocitose, este fator provavelmente contribui para a entrada do vírus vaccinia. Isto representa um outlier exemplo da tela. Virus = verde, núcleos = blue.