Inductie en beoordeling van klasse Switch recombinatie in gezuiverd Murine B-cellen
Summary
Na blootstelling aan antigeen, subpopulaties van geactiveerde B-cellen worden onderworpen aan een proces dat bekend staat als klasse switch recombinatie (CSR) van antilichamen isotypen te produceren met verschillende effector functies. Het protocol beschreven in dit rapport legt uit hoe MVO kan worden opgewekt en geanalyseerd<em> In vitro</em> Voor de doeleinden van het bestuderen van B-cel-functie.
Abstract
Humorale immuniteit is de tak van het immuunsysteem onderhouden door B-cellen en gemedieerd door de secretie van antilichamen. Bij de B-cel activatie, de immunoglobuline locus ondergaat een reeks van genetische modificaties te veranderen het bindend vermogen en effector functie van de uitgescheiden antilichamen. Dit proces wordt benadrukt door een genomische recombinatie gebeurtenis bekend als klasse switch recombinatie (CSR), waarin de standaard IgM-antilichaam isotype is vervangen door een van de IgG, IgA of IgE. Elke isotype beschikt over verschillende effector functies waardoor MVO cruciaal voor het behoud van de immuniteit.
Diversificatie van de immunoglobuline locus wordt gemedieerd door het enzym activatie-geïnduceerde cytidinedeaminase (AID). Een schematische video beschrijft dit proces in detail is online beschikbaar (http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html). AID activiteit en het MVO-pad worden over het algemeen bestudeerd in de beoordeling van de B-cel functie en humorale immuniteit bij muizen. Het protocol beschreven in dit rapport presenteert een methode van B-cel isolatie van murine milt en de daaropvolgende stimulatie met bacteriële lipopolysaccharide (LPS) te bewegen klasse overschakelen naar IgG3 (voor andere antilichaam isotypes zie tabel 1). Daarnaast is de fluorescente kleurstof cel vlekken carboxyfluoresceïne succinimidylester (CFSE) gebruikt om de celdeling van de gestimuleerde cellen, een proces dat van cruciaal belang om over te stappen 1, 2 isotype monitor.
De regulering van de AID en het mechanisme waarmee MVO gebeurt nog steeds onduidelijk en dus in-vitro-klasse switch testen leveren een betrouwbare methode voor het testen van deze processen in verschillende muismodellen. Deze testen zijn eerder gebruikt in de context van gen-deficiëntie gebruik van knock-out muizen 3. Bovendien kan in vitro schakelen van B-cellen worden voorafgegaan door virale transductie voor het moduleren van genexpressie door RNA knockdown of transgenexpressie 4-6. De gegevens van dit soort experimenten hebben beïnvloed ons begrip van de AID activiteit, resolutie van de MVO-reactie, en antilichaam-gemedieerde immuniteit in de muis.
Protocol
Discussion
Het protocol hierboven geschetste biedt een standaard test om AID expressie en functie analyseert tijdens de les schakelen van de primaire muizen B-cellen. Dit protocol maakt gebruik van bacteriële LPS te induceren schakelen van IgM naar IgG3, maar aanpassingen aan de stimulatie media kan worden gemaakt om te bewegen te schakelen naar andere isotypen (samengevat in Tabel 1 8, 9).
We hebben opgemerkt dat, voor nog onbekende redenen, foetaal kalf serum kan het niveau van de klasse …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn dankbaar voor de Martin laboratorium voor nuttige discussies. Deze publicatie wordt ondersteund door een subsidie van het Canadian Institute of Health Research (MOP-89783). AM wordt ondersteund door een Canada Research Chair Tier II Award.
Materials
| Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190 | ||
| EasySep Mouse B Cell Enrichment Kit | Stemcell Technologies | 19754 | ||
| Polystyrene tubes | Becton Dickinson Falcon | 352058 | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7030 | ||
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C34554 | ||
| Bovine Calf Serum | HyClone | SH30072.03 | ||
| RPMI 1640 Culture Medium | Gibco | 11875 | ||
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli | Sigma Aldrich | L6529 | ||
| β-mercaptoethanol | Gibco | 21985 | ||
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30396.03 | ||
| Normal Mouse Serum | Jackson ImmunoResearch | 011-000 | ||
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | Becton Dickinson Pharmingen | 553141 | ||
| Rat Anti-Mouse IgG3 | Becton Dickinson Pharmingen | 553401 |
Referenzen
- Hodgkin, P. D., Lee, J. H., Lyons, A. B. B cell differentiation and isotype switching is related to division cycle number. J Exp Med. 184, 277-281 (1996).
- McCall, M. N., Hodgkin, P. D. Switch recombination and germ-line transcription are division-regulated events in B lymphocytes. Biochim Biophys Acta. 1447, 43-50 (1999).
- Manis, J. P. 53BP1 links DNA damage-response pathways to immunoglobulin heavy chain class-switch recombination. Nat Immunol. 5, 481-487 (2004).
- de Yebenes, V. G. miR-181b negatively regulates activation-induced cytidine deaminase in B cells. J Exp Med. 205, 2199-2206 (2008).
- McBride, K. M. Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation. J Exp Med. 205, 2585-2594 (2008).
- Ramachandran, S. The RNF8/RNF168 ubiquitin ligase cascade facilitates class switch recombination. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 809-8014 (2010).
- Zaheen, A. AID constrains germinal center size by rendering B cells susceptible to apoptosis. Blood. 114, 547-554 (2009).
- Chaudhuri, J., Alt, F. W. Class-switch recombination: interplay of transcription, DNA deamination and DNA repair. Nat Rev Immunol. 4, 541-552 (2004).
- Kaminski, D. A., Stavnezer, J. Stimuli that enhance IgA class switching increase histone 3 acetylation at S alpha, but poorly stimulate sequential switching from IgG2b. Eur J Immunol. 37, 240-251 (2007).
- Kaminski, D. A., Stavnezer, J. Antibody class switching differs among SJL, C57BL/6 and 129 mice. Int Immunol. 19, 545-556 (2007).
