Microinyección embrionaria: una técnica para entregar un compuesto en la yema de pez cebra
Published: April 30, 2023
Abstract
Fuente: Sorlien, E. L., et al. Producción e identificación eficientes de knockouts genéticos generados por CRISPR/Cas9 en el sistema modelo Danio rerio. J. Vis. Exp. (2018).
Este video describe una técnica de microinyección embrionaria para entregar compuestos en saco de yema de pez cebra.
Protocol
1. Microinjeción de componentes CRISPR en embriones de pez cebra Instalar tanques de cría la noche antes de inyectar colocando el número de machos y hembras deseados (típicamente 2 hembras y 1 o 2 machos) en un tanque de cría con un divisor en su lugar. Prepare una placa de microinjeción con 1,5% de agarose en 1x medios E3 (ver Tabla de Materiales) con 0,01% azul metileno (un fungicida) vertiendo 35 ml de la agarose derretida en una placa Petri de 10 cm y colocando suavemente un…
Representative Results
Figura 1: Comparación de la salud de 24 embriones inyectados por HPF. Un embrión vivo (A) desarrollado a 24 CV, se distingue fácilmente de un embrión que ha abortado el desarrollo (B). Los embriones que se asemejan a (B) o tienen características drásticamente alteradas a (A), como la curvatura espinal o el desarrollo alterado de la cabeza y los ojos deben ser retirados del plato
Materials
| RNase-free water | Any brand | Synthesis of guide RNAs. Thermo Fisher and Qiagen both carry suitable water. |
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| E3 embryo media | Made in house | Media for raising embryos and making injeciton plate. Recipe: http://cshprotocols.cshlp.org/ content/2011/10/pdb.rec66449 |
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| Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Added to 1x E3 media to prevent fungal growth on embryos. |
| Petri dish | Thermo Fisher | FB0875711Z | Store embryos, cast injection plate |
| Agarose | Denville | CA3510-8 | Casting injection plate, agarose gels. |
| Microinection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | To create wells to hold embryos during injection |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P0290 | Dye for visualization of injection |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5904-5ML | To calibrate needle injection volume. |
| Transfer pipettes | Any brand | Moving embryos | |
| Razor blade | Thermo Fisher | 11295-10 | Cutting injection needle, tail clipping adult fish. |
| Incubator | Maintaining embryos at 28.5 C. | ||
| Verticle pipette puller | David Kopf Instruments | 700C | Geneate needles for injection. Additional needle pulling instructions: http:// cshprotocols.cshlp.org/ content/2006/7/pdb.prot4651.long |
| Capillary tubes | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Geneate needles for injection. |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | Load solution into injection needles |
| Microinjector | World Precision Instruments | PV 820 | Injecting embryos. |
| Disecting microscope | Leica | Injecting embryos. | |
| Microwave | Any brand | Casting injection plate, agarose gels. | |
| Scale | Any brand | Casting injection plate, agarose gels. | |
| Gloves | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| N2 | Any brand | To expell liquid from the capillary for embryo injection | |
| PCR strip tubes | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| 200 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| 10 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| Micropipettes | Any brand | For all aspects of the protocol. |
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Embryo Microinjection: A Technique to Deliver a Compound into the Zebrafish Yolk. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e20196, doi: (2023).