Microinjeção de Embriões: Uma técnica para entregar um composto na gema zebrafish
Published: April 30, 2023
Abstract
Fonte: Sorlien, E. L., et al. Produção e Identificação Eficientes de Nocautes genéticos gerados pelo CRISPR/Cas9 no sistema de modelo Danio rerio. J. Vis. Exp. (2018).
Este vídeo descreve uma técnica de microinjeção de Embrião para entregar compostos no saco de gema zebrafish.
Protocol
1. Microinjeção de componentes CRISPR em embriões de zebrafish Configure tanques de reprodução na noite anterior à injeção colocando o número de machos e fêmeas desejados (tipicamente 2 fêmeas e 1 ou 2 machos) em um tanque de reprodução com um divisor no lugar. Prepare uma placa de microinjeção com 1,5% de agarose em 1x E3 media (ver Tabela de Materiais) com 0,01% de azul de metileno (um fungicida) derramando 35 mL da agarose derretida em uma placa de Petri de 10 cm e c…
Representative Results
Figura 1: Comparação da saúde de embriões injetados de 24 hpf. Um embrião vivo (A) desenvolvido a 24 hpf, é facilmente distinguido de um embrião que abortou o desenvolvimento (B). Embriões que se assemelham (B) ou têm características drasticamente alteradas para (A), como curvatura espinhal ou desenvolvimento alterado da cabeça e dos olhos devem ser removidos do prato
Materials
| RNase-free water | Any brand | Synthesis of guide RNAs. Thermo Fisher and Qiagen both carry suitable water. |
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| E3 embryo media | Made in house | Media for raising embryos and making injeciton plate. Recipe: http://cshprotocols.cshlp.org/ content/2011/10/pdb.rec66449 |
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| Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Added to 1x E3 media to prevent fungal growth on embryos. |
| Petri dish | Thermo Fisher | FB0875711Z | Store embryos, cast injection plate |
| Agarose | Denville | CA3510-8 | Casting injection plate, agarose gels. |
| Microinection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | To create wells to hold embryos during injection |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P0290 | Dye for visualization of injection |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5904-5ML | To calibrate needle injection volume. |
| Transfer pipettes | Any brand | Moving embryos | |
| Razor blade | Thermo Fisher | 11295-10 | Cutting injection needle, tail clipping adult fish. |
| Incubator | Maintaining embryos at 28.5 C. | ||
| Verticle pipette puller | David Kopf Instruments | 700C | Geneate needles for injection. Additional needle pulling instructions: http:// cshprotocols.cshlp.org/ content/2006/7/pdb.prot4651.long |
| Capillary tubes | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Geneate needles for injection. |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | Load solution into injection needles |
| Microinjector | World Precision Instruments | PV 820 | Injecting embryos. |
| Disecting microscope | Leica | Injecting embryos. | |
| Microwave | Any brand | Casting injection plate, agarose gels. | |
| Scale | Any brand | Casting injection plate, agarose gels. | |
| Gloves | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| N2 | Any brand | To expell liquid from the capillary for embryo injection | |
| PCR strip tubes | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| 200 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| 10 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| Micropipettes | Any brand | For all aspects of the protocol. |
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Embryo Microinjection: A Technique to Deliver a Compound into the Zebrafish Yolk. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e20196, doi: (2023).