Gonad Microinjection: C. elegans'ın Germline'ına Doğrudan Bileşik Teslimat Yöntemi
Published: April 30, 2023
Abstract
Kaynak: Farboud, B. vd, Çeşitli Hücrelerde ve Organizmalarda Cas9 Ribonucleoprotein ile Gelişmiş Genom Düzenleme. J. Vis. Exp. (2018).
Bu videoda transgenik C. elegans suşları oluşturmanın yaygın bir yöntemi olan mikroenjeksiyon açıklanmaktadır. Örnekte, CRISPR tabanlı gen düzenleme için ribonikleoprotein (RNP) kompleksini tanıtmak için kullanılan mikroenjeksiyonları göreceğiz.
Protocol
Aşağıdaki protokol Farboud ve ark, Çeşitli Hücre ve Organizmalarda Cas9 Ribonucleoprotein ile Geliştirilmiş Genom Düzenleme, J. Vis. Exp. (2018) bir alıntıdır. 1. RNP Montajı Tüm RNA, DNA ve protein bileşenlerini önceden elde ederek deneyi önceden tasarlayın. İlk geçiş olarak, Tablo 1’de listelenen pozitif ko…
Representative Results
Tablo 1: Ön genom düzenleme deneyleri için pozitif kontroller. Bu tablo, bu protokolde açıklanan hücrelerin ve organizmaların her birinde ilk kez genom düzenleme denemesi gerçekleştirmek için gereken temel bilgileri gösterir. Bu parametrelerin ardından, deneyci kendi çıkarlarını taşıyan bir geni hedefledikten sonra protokolü test etmek veya karşılaştırma için bir temel olarak kulla…
Materials
| Reagents/Materials | |||
| DNA oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | – | IDT will provide custom DNA sequences, including those in Table 1 |
| Guide RNAs | Synthego | – | Synthego will provide high-quality sgRNAs for S. pyogenes Cas9, including custom sgRNAs containing the targeting sequences included in Table 1 |
| Purified Cas9 protein (EnGen Cas9 NLS, S. pyogenes) | New England Biosciences | M0646T | If possible, purifying Cas9 in-house or purchasing from local core facilities is a less expensive option |
| OP50 Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center | OP-50 | https://cgc.umn.edu/ |
| Nematode Growth Media agar in petri dishes | – | – | See Stiernagle, T (ref. 59) |
| Standard borosilicate glass capillaries with filament: 4 in (100 mm), 1/0.58 OD/ID | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Single-barrel standard borosilicate glass capillaries: 6 in (152 mm), 2/1.12 OD/ID | World Precision Instruments | 1B200-6 | |
| Cover glass; 24 × 50 mm | Thermo Fisher Scientific | 12-544E | |
| Cover glass; 22 × 22 mm | Thermo Fisher Scientific | 12-518-105K | |
| Apex LE agarose | Genesee Scientific | 20-102 | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-100ML | |
| pCFJ90 plasmid | Addgene | 19327 | |
| Capillary tubes with filament: 4 in (1.0 mm) | World Precision Instruments | T2100F-4 | |
| Petri dishes (100 × 15 mm) | – | ||
| 9" pasteur pipettes | – | ||
| Nuclease-free water | – | ||
| Equipment | |||
| MZ75 Stereomicroscope | Leica | Out-of-production. Current model is the M80 Stereomicroscope | |
| Axio Vert35 inverted phase contrast fluorescent microscope | Zeiss | Out-of-production. Current model is the Axio VertA.1 | |
| Laser-based micropipette puller (for C. elegans protocol) | Sutter Instrument | FG-P2000 | |
| Picoliter Microinjector (for C. elegans protocol) | Warner Instruments | PLI-100A | |
| Three-axis Joystick oil hydraulic micromanipulator | Narishige International | MO-202U | |
| Coarse manipulator | Narishige International | MMN-1 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| NG-agar |
Diesen Artikel zitieren
Gonad Microinjection: A Method of Compound Delivery Directly into the Germline of C. elegans. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e20168, doi: (2023).