Gonad 미세 주입 : C. 예르건의 생식선으로 직접 화합물 전달 방법
Published: April 30, 2023
Abstract
출처: Farboud, B. 외, 다양한 세포및 유기체에서 Cas9 리보뉴클레오프로틴으로 향상된 게놈 편집. J. 비스 익스펙. (2018).
이 비디오는 형질전환 C. elegans 균주를 만드는 일반적인 방법인 미세 주입을 설명합니다. 예에서, 우리는 CRISPR 염기 유전자 편집을 위한 리보뉴클레오단백질(RNP) 복합체를 소개하는 데 사용되는 미세 주입을 볼 것이다.
Protocol
다음 프로토콜은 다양한 세포및 유기체에서 Cas9 리보뉴클레오프로틴을 통한 향상된 게놈 편집, J. Vis. Exp. (2018)에서 발췌한 것입니다. 1. RNP 어셈블리 모든 RNA, DNA 및 단백질 성분을 미리 획득하여 사전에 실험을 설계하십시오. 첫 번째 패스로 표 1에 나…
Representative Results
표 1: 예비 게놈 편집 실험에 대한 긍정적인 제어. 이 표는 이 프로토콜에 기술된 각 세포 및 유기체에서 처음 게놈 편집 실험을 수행하는 데 필요한 주요 정보를 보여줍니다. 이러한 매개 변수에 따라 실험자가 자신의 관심 유전자를 대상으로 한 후 프로토콜을 테스트하거나 비교를 위한 기준선으로 사용될 수…
Materials
| Reagents/Materials | |||
| DNA oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | – | IDT will provide custom DNA sequences, including those in Table 1 |
| Guide RNAs | Synthego | – | Synthego will provide high-quality sgRNAs for S. pyogenes Cas9, including custom sgRNAs containing the targeting sequences included in Table 1 |
| Purified Cas9 protein (EnGen Cas9 NLS, S. pyogenes) | New England Biosciences | M0646T | If possible, purifying Cas9 in-house or purchasing from local core facilities is a less expensive option |
| OP50 Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center | OP-50 | https://cgc.umn.edu/ |
| Nematode Growth Media agar in petri dishes | – | – | See Stiernagle, T (ref. 59) |
| Standard borosilicate glass capillaries with filament: 4 in (100 mm), 1/0.58 OD/ID | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Single-barrel standard borosilicate glass capillaries: 6 in (152 mm), 2/1.12 OD/ID | World Precision Instruments | 1B200-6 | |
| Cover glass; 24 × 50 mm | Thermo Fisher Scientific | 12-544E | |
| Cover glass; 22 × 22 mm | Thermo Fisher Scientific | 12-518-105K | |
| Apex LE agarose | Genesee Scientific | 20-102 | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-100ML | |
| pCFJ90 plasmid | Addgene | 19327 | |
| Capillary tubes with filament: 4 in (1.0 mm) | World Precision Instruments | T2100F-4 | |
| Petri dishes (100 × 15 mm) | – | ||
| 9" pasteur pipettes | – | ||
| Nuclease-free water | – | ||
| Equipment | |||
| MZ75 Stereomicroscope | Leica | Out-of-production. Current model is the M80 Stereomicroscope | |
| Axio Vert35 inverted phase contrast fluorescent microscope | Zeiss | Out-of-production. Current model is the Axio VertA.1 | |
| Laser-based micropipette puller (for C. elegans protocol) | Sutter Instrument | FG-P2000 | |
| Picoliter Microinjector (for C. elegans protocol) | Warner Instruments | PLI-100A | |
| Three-axis Joystick oil hydraulic micromanipulator | Narishige International | MO-202U | |
| Coarse manipulator | Narishige International | MMN-1 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| NG-agar |
Diesen Artikel zitieren
Gonad Microinjection: A Method of Compound Delivery Directly into the Germline of C. elegans. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e20168, doi: (2023).