غوند Microinjection: طريقة تسليم المركب مباشرة إلى الجرثومة من C. elegans
Published: April 30, 2023
Abstract
المصدر: فاربود، ب. وآخرون، تحرير الجينوم المعزز مع Cas9 Ribonucleoprotein في الخلايا والكائنات الحية المتنوعة. ج. فيس إكسب. (2018).
يصف هذا الفيديو الميكروبيكشن، وهي طريقة شائعة لخلق سلالات سي إليغانز المعدلة وراثيا. في المثال، سنرى microinjection تستخدم لإدخال ريبونوكليوبروتين (RNP) مجمع لتحرير الجينات كريسبر القواعد.
Protocol
البروتوكول التالي هو مقتطف من Farboud وآخرون، تحرير الجينوم المحسن مع Cas9 Ribonucleoprotein في الخلايا والكائنات الحية المتنوعة، J. Vis. Exp. (2018). 1. جمعية RNP تصميم التجربة في وقت مبكر، والحصول على جمي?…
Representative Results
الجدول 1: ضوابط إيجابية للتجارب الأولية لتحرير الجينوم. يعرض هذا الجدول المعلومات الرئيسية اللازمة لإجراء تجربة تحرير الجينوم لأول مرة في كل من الخلايا والكائنات الحية الموصوفة في هذا البروتوكول. ومن المرجح أن يؤدي اتباع هذه…
Materials
| Reagents/Materials | |||
| DNA oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | – | IDT will provide custom DNA sequences, including those in Table 1 |
| Guide RNAs | Synthego | – | Synthego will provide high-quality sgRNAs for S. pyogenes Cas9, including custom sgRNAs containing the targeting sequences included in Table 1 |
| Purified Cas9 protein (EnGen Cas9 NLS, S. pyogenes) | New England Biosciences | M0646T | If possible, purifying Cas9 in-house or purchasing from local core facilities is a less expensive option |
| OP50 Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center | OP-50 | https://cgc.umn.edu/ |
| Nematode Growth Media agar in petri dishes | – | – | See Stiernagle, T (ref. 59) |
| Standard borosilicate glass capillaries with filament: 4 in (100 mm), 1/0.58 OD/ID | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Single-barrel standard borosilicate glass capillaries: 6 in (152 mm), 2/1.12 OD/ID | World Precision Instruments | 1B200-6 | |
| Cover glass; 24 × 50 mm | Thermo Fisher Scientific | 12-544E | |
| Cover glass; 22 × 22 mm | Thermo Fisher Scientific | 12-518-105K | |
| Apex LE agarose | Genesee Scientific | 20-102 | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-100ML | |
| pCFJ90 plasmid | Addgene | 19327 | |
| Capillary tubes with filament: 4 in (1.0 mm) | World Precision Instruments | T2100F-4 | |
| Petri dishes (100 × 15 mm) | – | ||
| 9" pasteur pipettes | – | ||
| Nuclease-free water | – | ||
| Equipment | |||
| MZ75 Stereomicroscope | Leica | Out-of-production. Current model is the M80 Stereomicroscope | |
| Axio Vert35 inverted phase contrast fluorescent microscope | Zeiss | Out-of-production. Current model is the Axio VertA.1 | |
| Laser-based micropipette puller (for C. elegans protocol) | Sutter Instrument | FG-P2000 | |
| Picoliter Microinjector (for C. elegans protocol) | Warner Instruments | PLI-100A | |
| Three-axis Joystick oil hydraulic micromanipulator | Narishige International | MO-202U | |
| Coarse manipulator | Narishige International | MMN-1 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| NG-agar |
Diesen Artikel zitieren
Gonad Microinjection: A Method of Compound Delivery Directly into the Germline of C. elegans. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e20168, doi: (2023).