Bu video makalede izole etmek için bir yöntem mevcut tek veya birden fazla<em> Drosophila</em> Kızılötesi yakalama (IR) Lazer Çekim Mikrodisseksiyon (LCM) sınıfı kullanarak üçüncü instar larvaları da nöronların. Izole nöronların elde edilen RNA kolayca QRT-PCR veya mikroarray analizleri de dahil olmak üzere aşağı uygulamalar için kullanılabilir.
Drosophila periferik sinir sistemi (PNS) (da) nöronların dendritik arborization sınıfa özel dendrit morfolojilerinden 1,2 altında yatan moleküler mekanizmaları araştırmak için mükemmel bir model sistemi sağlar. Moleküler analizlerin sınıf özgü da nöron gelişimi kolaylaştırmak için, saf bir nüfus bu hücreleri elde etmek için hayati önem taşımaktadır. Manyetik boncuk tabanlı hücre arıtma 3,4, Floresan Aktif Hücre Ayırma (FACS) 5-8 ve stratejileri 9 tabanlı RNA bağlayıcı protein de dahil olmak üzere Drosophila hücreler, farklı hücre ve doku-spesifik RNA izolasyon teknikleri bir dizi bulunmasına rağmen hiçbiri mekansal hassas bir yüksek derecesi ile tek veya birden fazla sınıf özel Drosophila da nöronların izole etmek için bu yöntemleri kolayca kullanılabilir. Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon (LCM), yüksek uzaysal çözünürlük ve doğruluk derecesi ile doku bölümleri belirli hücre türlerini izole etmek için kullanılabilecek bir derece güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Izole hücreler elde edilen RNA sonra Mah-PCR ve belirli bir hücre tipi 10-16 içinde mikroarray ifade profil de dahil olmak üzere analizler için kullanılabilir. LCM, bugüne kadar, üçüncü gelişim instar larval aşamada da nöronlar da dahil olmak üzere Drosophila doku ve hücreler 17,18, analizinde yaygın olarak uygulanan değil.
Burada LCM kızılötesi (IR) sınıfını kullanarak Drosophila da nöronların izolasyonu için optimize edilmiş protokol mevcut. Bu yöntem, yüksek özgüllük ve uzaysal çözünürlüğü ile tek, özel sınıf veya birden fazla da nöronların yakalamak için sağlar. UAS-mCD8 ifade Yaş uyumlu üçüncü instar larva: GFP 19 transgen kontrolü altında ya sınıfı IV da nöron spesifik PPK GAL4 20 sürücü veya pan-da nöron spesifik 21-7 GAL4 21 sürücü, bunlar için kullanılan deneyler. RNA izole da nöronların elde edilen çok yüksek kalitede ve doğrudan QRT-PCR veya mikroarray analizleri de dahil olmak üzere downstream uygulamalar için kullanılabilir. Ayrıca, bu LCM protokol diğer Drosophila hücre tipleri, hücre tipi GFP belirli, GAL4 odaklı ifade desen bağımlı bir kalkınma çeşitli aşamalarında yakalamak için kolayca adapte edilebilir .
Burada sunulan protokol LCM üzerinden Drosophila periferik nöronların izolasyonu için optimize edilmiş bir yöntem açıklanır . Bu LCM protokol gelişme üçüncü instar larva aşamasında tek, özel sınıf ya da birden fazla Drosophila da nöron spesifik izolasyonu için tasarlanmış iken, protokol küçük değişiklikler, kolaylıkla bütün gelişimsel diğer Drosophila hücre tipleri yakalamak için adapte olabilir aşamalarında, farklı GAL4 kullanarak, hücr…
The authors have nothing to disclose.
Biz Dr teşekkür ederim. LCM yardım için bu çalışmada kullanılan sinek hisse senetleri, ve Virginia Espina, Dr. Emanuel Petricoin ve Dr Lance Liotta sağlamak için Yuh-Nung Jan ve Wes Grueber. Yazarlar bu araştırma desteği (DNC) ve George Mason Üniversitesi Provost Ofisi (EPRI) Thomas F. ve Kate Miller Jeffress Memorial Trust kabul etmiş sayılırsınız.
Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | MP Bioproducts | PBS10X02 | Diluted to 1X working solution | |
2.5% Trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 | ||
RNase-AWAY | Sigma-Aldrich | 83931 | ||
Xylenes, histological grade | Fisher Scientific | X3S-4 | ||
RNAse-free water | Fisher Scientific | BP561-1 | ||
Optimal Cutting Temperature (OCT) compound | Tissue-Tek | 4583 | ||
PicoPure RNA Isolation Kit | Molecular Devices | KIT0204 | Follow manufacturer’s instructions | |
Thin walled reaction tube with domed cap | GeneAmp, Applied Biosystems | N8010611 | ||
ExtracSure Sample Extraction Device | Molecular Devices | LCM 0208 | ||
Incubation Block for sample extraction from CapSure HS Caps | Molecular Devices | LCM0505 | ||
Alignment Tray for CapSure HS LCM Caps and ExtracSure Sample Extraction Devices | Molecular Devices | LCM0504 | ||
CapSure HS LCM caps | Molecular Devices | LCM0213 | ||
75×100 mm glass slides | Fisher Scientific | 12-544-3 | ||
Tissue embedding molds | Fisher Scientific | NC9642669 | ||
Polypropylene pestle for 1.5 ml microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-5390 | ||
70% Ethanol; 95% Ethanol; 100% Ethanol | ||||
Dry ice |
Equipment: