Um passo-metabolômica: carboidratos, ácidos orgânicos e aminoácidos quantificados em um procedimento único
Summary
O método da urease de preparação de amostra para análise GC / MS de metabólitos intermediários é apresentado por seu inventor. O método permite uma etapa de acompanhamento da triagem neonatal para erros inatos por espectrometria de massa em tandem por carboidratos quantificar, orgânicos e aminoácidos tudo em um único processo.
Abstract
Cada criança nascida em os EUA estão agora selecionados para até 42 distúrbios genéticos raros chamado de "erros inatos do metabolismo". O método de rastreamento é baseado em espectrometria de massa e quantifica acilcarnitinas como uma tela de acidemias orgânicas e também medidas de aminoácidos. Todos os estados também realizam testes enzimáticos para distúrbios de carboidratos, como galactosemia. Porque os resultados podem ser não-específicos, testes de acompanhamento de resultados positivos é necessário usar um método mais definitivo. O presente relatório descreve o "urease" método de preparação de amostras para triagem de erros inatos. Enzima urease cristalino é usado para remover a uréia a partir de fluidos corporais que permite a maioria dos outros metabólitos solúveis em água para ser desidratado e derivatizado por cromatografia gasosa em um único procedimento. Desidratação por evaporação em um fluxo de nitrogênio é facilitada pela adição de acetonitrila e cloreto de metileno. Então, trimethylsilylation ocorre na presença de um único trifluoroacetato triethylammonium catalisador,. Injeção automatizada e cromatografia é seguido por macro-driven quantificação custom de 192 metabolitos e semi-quantificação de cada componente principal utilizando bibliotecas especializadas de espectros de massa de TMS derivatizado compostos biológicos. A análise pode ser realizada na plataforma ChemStation amplamente utilizado usando as macros e bibliotecas disponíveis do autor. Em nosso laboratório, mais de 16.000 amostras de pacientes foram analisados usando o método com um rendimento diagnóstico de cerca de 17% – ou seja, 17% dos resultados de amostras revelam descobertas que devem ser postas em prática pelo médico de ordenação. Entre estes, estão confirmadas mais de 180 erros inatos, dos quais cerca de 38% não poderia ter sido diagnosticada por meio de métodos anteriores.
Protocol
Discussion
O método urease (1) tem sido citado 62 vezes na literatura médica, com várias modificações. Grupo Matsumoto (2,3) simplificou o procedimento para high-throughput screening neonatal e relatou os resultados de 16.000 pacientes. Kuhara e outros (4-7) relataram o uso do método em vários casos de diagnóstico de erro inato e follow-up. Rhead (8) também confirmou a utilidade do método para o diagnóstico clínico e acompanhamento de erros inatos. O método tem sido aplicado a urina de ursos, camundongos knock-out, elefantes e homogeneizados de moscas da fruta inteira e suas larvas (9). Meios de cultura de Cryptococcus antes e depois do local dirigida mutagênese também foram analisados, sem a etapa urease (10). O método foi aplicado para avaliação nutricional em estudantes de medicina humana, de Down e pacientes com síndrome demencial veteranos idosos depois de carregar os indivíduos com doses orais dos aminoácidos triptofano, metionina e isoleucina (11). Todos os oito vitaminas B foram avaliados pela quantificação do produtos de degradação dos três aminoácidos que, entre eles, exigir que todas as oito vitaminas em algum momento de sua degradação. Os efeitos tóxicos de produtos farmacêuticos e sua mitigação pela suplementação de vitamina tem sido relatada (12). Amostras de líquido amniótico de gestações normais e síndrome de Down foram analisados e relatados (13-15).
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A assistência técnica capaz de Anthony Thomas é reconhecido agradecimento.
Materials
| Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| MSD 5975 | Agilent | GC/MS/Computer | ||
| MSD 5973 | Agilent | GC/MS/Computer | ||
| Urease | Calzyme | 116A0100 | Also Sigma C3 | |
| Stable Isotope Standards | CDN Isotopes, Isotec, Cambridge Isotope Lab | |||
| Solvents | Fisher | |||
| Analytes | Sigma, Universidad Autonoma de Madrid, Ernesto Brunet | |||
| GC Columns | J&W Scientific | 123-5026 | ||
| TEA/TFA | Fluka/Sigma | 09747 | ||
| Vials | Supelco/Sigma | Z115088/12EA | ||
| Merlin Microseal | Agilent | 5181-8815 | ||
| MSTFA | Thermal Scientific | 48913 |
Referenzen
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- Kuhara, T., Shinka, T., Inoue, Y., Ohse, M., Zhen-wei, X., Yoshida, I., Inokuchi, T., Yamaguchi, S., Takayanagi, M., Matsumoto, I. Pilot study of gas chromatographic-mass spectrometric screening of newborn urine for inborn errors of metabolism after treatment with urease. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 731 (1), 141-147 (1999).
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