Redémarrez direct d'une fourche de réplication bloquée par une polymérase ARN Head-On

Cette méthode a été utilisée dans la recherche présentée dans Pomerantz et O'Donnell, Science 327, 590-592 (2010) . 1. Assemblée d'un complexe d'élongation a été stoppé ARNP effectuée comme suit: 500 nM de concentration finale de E. ARNP coli σ 70 ans, il a été mélangé avec une concentration de 5 nM final d'une matrice d'ADN biotinylé 3,6 kb contenant le promoteur T7A1 dans 100 ul de tampon A (20 mM Tris-Cl (pH 7,5), 8 mM de MgCl2, 0,5 mM EDTA, 5 mM DTT, 10% glycérol) pendant 10 min à 37 ° C. 100 uM de l'APU et 40 uM de chacun de GTP, ATP, et CTP ont été ajoutés pour encore 10 min à 37 ° C. 2. Immobilisation du complexe d'élongation ARNP stoppé sur des billes de streptavidine a été effectuée comme suit: 200 ul de streptavidine billes magnétiques revêtues (Invitrogen) ont été ajoutés à la réaction ci-dessus pendant 10 min à température ambiante. 3. Purification du complexe immobilisé ARNP stoppé l'élongation a été effectuée comme suit: Les perles (en haut) ont été lavées 5 fois avec 0,9 ml de tampon A contenant 0,75 M de NaCl, 200 ug / ml d'héparine, et 20 pg / ml ADNss (Le surnageant a été éliminé après chaque étape de lavage par séparation magnétique.) Ensuite, le billes ont été lavées deux fois avec 0,9 ml de tampon A. 4. Formation d'une fourche de réplication en aval par rapport à la tête sur ARNP a été effectuée comme suit: Les perles (en haut) ont été remises en suspension dans 100 ul de tampon de la Nouvelle Angleterre Biolabs 4 et 10 unités de Sap I (New England Biolabs) a été ajouté pendant 10 min à 37 ° C. Les billes ont été lavées trois fois avec 0,9 ml de tampon A puis remis en suspension dans 50 pl de tampon de ligation réaction rapide T4 (New England Biolabs). 2 pi de ligase T4 rapide (New England Biolabs) a été ajouté avec 6 concentrations nM finale de pré-recuit ADN fourchue (RP10, RP22, RP25) pendant 10 min à température ambiante. Les billes ont été lavées trois fois avec 0,9 ml de tampon A. 5. Assemblée de l'réplisome et l'initiation de la synthèse des brins de premier plan à la fourche de réplication a été effectuée comme suit: 448 pmol de DnaB (comme hexamère) a été incubée avec les 150 perles ul de tampon A (20 mM de glycérol Tris-Cl (pH 7,5), 8 mM de MgCl2, 0,5 mM EDTA, 5 mM DTT, 10%) pendant 30 s à 23 ° C. 4.9 pmol de Pol III * (Pol III, il minus β), 15 pmol de β, ATP 2 mM, et 60 uM chacun de dGTP et dATP ont été ajoutés à un volume de 200 ul et incubée encore 5 min à 37 ° C. La réplication a été lancé lors de l'ajout de 10 mg et SSB 24 uM de chacun de dATP et dTTP avec [α-32 P] dTTP et [α-32 P] dCTP (activité spécifique, 3000-5000 cpm / pmol) pour un volume final de 250 ul. Réactions ont été interrompues au bout de 10 min après addition de 12 ul d'EDTA 500 mM. 6. Purification et la concentration de la radio-labellisés ADN a été effectuée comme suit: Les perles (en haut) ont été cuits après la réaction a été arrêtée afin d'éliminer l'ADN à partir des perles. Toute l'ADN résiduel restant attaché à billes a été éliminé en traitant les perles avec la protéinase K dans un volume de 10 ul pendant 30 min à 50 ° C. Les billes sont ensuite bouillies et le surnageant a été enlevé par séparation magnétique. Le surnageant contenant l'ADN combinée a été purifié en utilisant le kit Qiagen PCR Cleanup. Purifié radiomarqué produits d'ADN ont ensuite été analysés dans un gel d'agarose alcalines. Réplication * en l'absence d'une tête sur ARNP stoppé complexe d'élongation a été effectuée comme ci-dessus, cependant, σ 70 a été omise. Les résultats représentatifs: Collision de l'réplisome avec une tête sur ARNP se traduit généralement par deux produits de 2,5 kb et 3,6 kb de longueur. Le produit de 2,5 kb représente la longueur de l'ADN de la fourche à la ARNP stoppé et les résultats de réplisome décrochage lors d'une collision avec le ARNP. Le produit 3,6 kb représentent pleine longueur de l'ADN et les résultats de l'occupation soit incomplète du promoteur par ARNP ou partielle réplisome lecture par le biais de l'ARNP front. Un bon résultat ou précis démontre qu'environ 50% de la pleine-longueur de l'ADN est produit. Toutefois, dans certains cas, moins d'occupation du promoteur par ARNP se produit et un pourcentage plus élevé de toute la longueur ADN est observée depuis une plus grande population de replisomes ne rencontrent pas une ARNP front. Réplication en l'absence d'un résultat ARNP stoppé en seulement plein longueur de l'ADN (3,6 kb). Figure. 1 Le réplisome est entravée par un ARNP front. (A) Montage expérimental. Un E. Coli ARNP complexe d'élongation arrêté a été assemblé sur un ADN biotinylé contenant le promoteur T7A1 comme décrit précédemment (9). Brièvement, un complexe d'élongation arrêté a été formé 20 bps aval du promoteur en incubant holoenzyme ARNP avec l'ADN biotinylé pendant 10 min suivi par l'ajout d'Apu, le GTP, ATP, CTP et pendant encore 10 min. Billes de streptavidine ont été ajoutés pour encore 10 min puis les billes ont été lavées cinq fois chacune avec 0,9 ml de tampon contenant 0,75 M de NaCl, 200 mg / ml d'héparine, et 100 nM seul brin d'ADN pour retirer instables ARNP complexes ADN-et PNT excès . L'ADN a ensuite été digéré avec Sapi, lavées, et ligué à un ADN pré-recuit fourchue. Les billes ont été lavées à nouveau avant l'assemblage du réplisome. Le promoteur est situé à 2,5 kb de la fourche et est orientée à la transcription directe vers la fourche (B). DnaB a été ajouté puis le réplisome a été assemblé et la réplication a été initié, soit en présence (piste 2) ou l'absence (piste 1) d'un front ARNP.