Vi rapporterar utvecklingen av ett system för automatiserad bildbehandling och analys av zebrafisk transgena embryon i multispot plattor. Detta visar på möjligheten att mäta dosberoende effekter av en liten molekyl, BCI, på Fibroblast Growth Factor reporter genuttryck och erbjuda teknik för att fastställa hög genomströmning skärmar zebrafisk kemikalie.
Vi visar tillämpningen av bildbaserade hög halt screening (HCS) metod för att identifiera små molekyler som kan modulera FGF / RAS / MAPK väg i zebrafisk embryon. Den zebrafisk embryot är ett idealiskt system för in vivo hög halt kemiska skärmar. Den 1-dags gammal embryot är ca 1 mm i diameter och kan enkelt klädd i 96-hålsplattor, ett standardformat för hög throughput screening. Under den första dagen av utveckling, embryon är transparenta med de flesta av de stora organen närvarande, vilket möjliggör visualisering av vävnad bildas under fosterutvecklingen. Den kompletta automatisering av zebrafisk kemiska skärmar är fortfarande en utmaning, men framför allt i utvecklingen av automatiserade bild insamling och analys. Vi genererade tidigare en transgen reporter linje som uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP) under kontroll av FGF aktivitet och visat sin nytta i kemiska skärmar<sup> 1</sup>. Att etablera metodik för hög genomströmning hela organismen skärmar har vi utvecklat ett system för automatiserad bildbehandling och analys av zebrafisk embryon till 24-48 timmar efter befruktning (HPF) i 96-brunnars plattor<sup> 2</sup>. I denna video vi lyfta fram rutiner för arraying transgena embryon i multispot plattorna vid 24hpf och tillägget av en liten molekyl (BCI) som hyperactivates FGF signalering<sup> 3</sup>. Plattorna inkuberas i 6 timmar, följt av tillsats av tricaine att söva larver innan automatiserad bildbehandling på molekylär enheter ImageXpress Ultra laserskanning konfokala HCS läsare. Bilderna bearbetas av Definiens Utvecklare programvara med en Kognition algoritm nätverksteknik som vi utvecklat för att upptäcka och kvantifiera uttryck av GFP i huvudet av transgena embryon. I detta exempel har vi lyfta fram möjligheten för algoritm för att mäta dosberoende effekter BCI på GFP reporter genuttryck i behandlade embryon.
En viktig faktor som begränsar genomströmningen av zebrafisk kemiska skärmar är bristen på metoder för att systematiskt bearbeta 96-brunnar för avbildning och analys. Eftersom bilder av flercelliga organismer är komplexa, låg kontrast och heterogena i naturen, befintliga bildanalys algoritmer misslyckas med att upptäcka och kvantifiera specifika strukturer inom organismen. De flesta publicerade zebrafisk kemiska skärmar innebär därför visuell undersökning av enskilda brunnar av hängivna personal under hela förfarandet. Detta förhindrar vanligtvis generationen av numeriska avläsning och en komplett arkivering av skärmbilder och data. Dessutom eliminerar manuell utvärdering flera viktiga fördelar av bild-screening, det vill säga förmågan att leda retrospektiva analyser av skärmens prestanda, för att undersöka fenotypiska förändringar som inte var det primära målet för screening kampanjen (t.ex. toxicitet eller utveckling fel) och att korsa referens screening data med tidigare eller framtida skärmar med samma förening bibliotek.
I denna rapport lyfter vi fram metodik för automatiserad bildbehandling och analys av zebrafisk embryon multispot plattor utan att användaren behöver. Vi automatiserade Bildinsamling på en ImageXpress Ultra laserskanning konfokala läsare (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) för att bilden Tg (dusp6: d2EGFP) PT6 embryon i 96 brunnar och utvecklat en algoritm bild analys baserad på Definiens "Cognition nätverksteknik som kvantifieras GFP uttryck i huvudet av transgena embryon. Metoden levereras graderade svar och kvantifieras in vivo aktivitet hos en liten molekyl aktivator av FGF signalering. Liknande resultat erhölls med epifluorescence-baserade ArrayScan II (Cellomics Inc, Pittsburgh PA) dokumentera att det är möjligt att genomföra automatiserade ta bilder zebrafisk embryon på olika kommersiellt tillgängliga plattan läsare 2. Utvecklingen av metoder för att automatiskt analysera flercellig organism bilder eliminerat behovet av visuella poängsättning av den mänskliga observatören och gjorde det möjligt för generering och arkivering av numeriska data och bilder för retrospektiv analys och jämförelser med framtida skärmar.
Detta arbete finansieras av NICHD / NIH (1R01HD053287) till Hukriede, NCI / NIH (P01 CA78039) till Vogt och NHLBI / NIH (1R01HL088016) till Tsang.
Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Tricaine (MS222) | Sigma | Cat.# A-5040 |