Multicolor Citometria a Flusso di analisi Cellular risposta immunitaria in macachi Rhesus
Summary
Abbiamo dimostrato l'utilità di citometria a flusso multicolore per informazioni dettagliate caratterizzazione fenotipica e funzionale del totale così come sottoinsiemi memoria di CD4 + e CD8 + T nei macachi rhesus, il modello ideale per l'HIV / AIDS studi vaccino.
Abstract
Il modello di macaco rhesus è attualmente il miglior modello disponibile per l'HIV-AIDS rispetto alla comprensione della patogenesi e per lo sviluppo di vaccini e terapie<sup> 1,2,3</sup>. Qui, descriviamo un metodo per l'analisi dettagliate fenotipica e funzionale delle risposte immunitarie cellulari, in particolare la produzione di citochine intracellulari di CD4 + e CD8 + T, oltre che i sottoinsiemi memoria individuale. Abbiamo ottenuto precise misure quantitative e qualitative per la produzione di interferone gamma (INF-) e interleuchina (IL) -2 in entrambi i CD4 + e CD8 + T cellule del macaco rhesus PBMC stimolati con PMA più ionomicina (PMA + I). I profili delle citochine erano diverse nei diversi sottoinsiemi di celle di memoria. Inoltre, questo protocollo ci ha fornito la sensibilità per dimostrare anche le frazioni minori di specifico antigene CD4 + e CD8 + sottogruppi di cellule T nei campioni di PBMC da macachi rhesus immunizzati con un vaccino cocktail busta peptide HIV sviluppate nel nostro laboratorio. La tecnica di citometria a flusso multicolore è un potente strumento per identificare con precisione le diverse popolazioni di cellule T<sup> 4,5</sup> Con citochine capacità di produzione<sup> 6</sup> In seguito a stimolazione aspecifica o antigene-specifiche<sup> 5,7</sup>.
Protocol
Acknowledgements
Dr. Pramod Nehete e la signora Bharti Nehete macaco di sangue e campioni PBMC; Questo lavoro è stato parzialmente supportato con fondi dal NIH concedere AI 46969, e tutti i terreni di coltura cellulare sono stati prodotti dai Media Central Laboratory, che è finanziato dal NIH concedere CA 16672.
Materials
Solution and Buffers
- Ficoll-Hypaque (Histopaquen-1077, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- RPMI-1640 medium (HyClone laboratories, Logan, UT)
- Fetal Bovine Serum (FBS), (HyClone laboratories, Logan, UT)
- L-glutamine (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO)
- Penicillin/streptomycin (Invitrogen; Carlsbad, CA)
- Trypan blue reagent (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO)
- 50 mM Tris, PH 8.6; filtered and store at 4°C
- Dulbecco’s PBS (DPBS, Ca2/Mg2-free; Life technologies, Rockville, MD)
- Flow wash buffer: DPBS supplement with 2% FBS, store at 4°C
- BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit (BD Biosciences; San Jose, CA)
Activation agents
- Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- Ionomycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- Costimulatory mAb CD49d, clone 9F10 (BD Biosciences; San Jose, CA)
- Affinity purified antibody F (ab )2 fragments of Goat Anti-Mouse IgG (H + L) (Kierkegaard and Perry Laboratory, Gaithersburg, MD)
- Specific activation agents could include peptide pools, single peptide, or whole protein
Cytokine secretion inhibitors
- Brefedin A (BFA, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)
- Golgi Plug can be used alternatively (BD Biosciences; San Jose, CA)
Antibodies
- Live/dead fixable aqua fluorescent stain kit (Invitrogen; Carlsbad, CA)
- CD3 PE-Cy7 (SP34-2), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- CD4 pacific blue (OKT4), (eBiosciences (San Diego, CA)
- CD8 Alexa700 (RPA-T8), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- CD28 PerCP-cy5.5 (L293), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- CD95 APC (DX2), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- IFN- FITC (B27), (BD Biosciences; San Jose, CA)
- IL-2 PE (MQ1-17H12), (BD Biosciences; San Jose, CA)
Referenzen
- Ogg, G. S. Quantitation of HIV-1-specific cytotoxic T lymphocytes and plasma load of viral RNA. Science. 279, 2103-2106 (1998).
- Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection. J Virol. 68, 6103-6110 (1994).
- Koup, R. A. Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome. J Virol. 68, 4650-4655 (1994).
- Walker, J. M., Maecker, H. T., Maino, V. C., Picker, L. J. Multicolor flow cytometric analysis in SIV-infected rhesus macaque. Methods Cell Biol. 75, 535-557 (2004).
- Pitcher, C. J. Development and homeostasis of T cell memory in rhesus macaque. J Immunol. 168, 29-43 (2002).
- Jung, T., Schauer, U., Heusser, C., Neumann, C., Rieger, C. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. J Immunol Methods. 159, 197-207 (1993).
- Keeney, T. S., Nomura, L. E., Maecker, H. T., Sastry, K. J. Flow cytometric analysis of macaque whole blood for antigen-specific intracellular cytokine production by T lymphocytes. J Med Primatol. 32, 23-30 (2003).
- Gauduin, M. C. Optimization of intracellular cytokine staining for the quantitation of antigen-specific CD4+ T cell responses in rhesus macaques. J Immunol Methods. 288, 61-79 (2004).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243, 77-97 (2000).
- De Rosa, S. C., Herzenberg, L. A., Roederer, M. 1. 1. -. c. o. l. o. r. 13-parameter flow cytometry: identification of human naive T cells by phenotype, function, and T-cell receptor diversity. Nat Med. 7, 245-248 (2001).
- Tung, J. W., Parks, D. R., Moore, W. A., Herzenberg, L. A. New approaches to fluorescence compensation and visualization of FACS data. Clin Immunol. 110, 277-283 (2004).
