Dual Somatische Opnames van gonadotrofine-releasing hormoon (GnRH) Neuronen Geïdentificeerd door Green Fluorescent Protein (GFP) in Hypothalamic Slices

Hypothalamus hersenen plakjes worden voorbereid, geïncubeerd en overgedragen aan de opname kamer zoals eerder gedetailleerd (9) in de dieren waarvan de GnRH neuronen te uiten groen fluorescerend eiwit (GFP) onder de controle van de GnRH peptide promotor (10). Na het verwijderen van de hersenen van het dier, is de hersenen geblokkeerd met behulp van een scheermesje om regio's die niet van belang zijn te elimineren. Om de regio's te verwijderen bepalen, wordt de hersenen gelegd op de dorsale oppervlak, zodat de hypothalamus kunnen worden gevisualiseerd. Voor zowel de coronale en sagittale slice oriëntaties, is het cerebellum verwijderd. Voor coronale slice voorbereiding, is de rostrale deel van de cortex verwijderd. In deze slice oriëntatie, de laterale gebieden van de cortex bieden ondersteuning voor het snijden van de hersenen en voldoende gebied van de hersenen voor de plaatsing van zilveren draden aan de hersenen in de opname kamer veilig te stellen. Voor de sagittale slice voorbereiding, zijn de laterale delen van de hersenen verwijderd en de rostrale delen van de cortex bieden de ondersteuning van de hersenen snijden en voor de plaatsing van zilver draden naar de hersenen in de opname goed te beveiligen. Gedurende de procedure te blokkeren, is het brein continu bevochtigd met koude kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) met behulp van een glazen pipet. Een kleine hoeveelheid Superglue wordt geplaatst op de snij-platform. De hersenen zijn opgeheven met een spatel. Overtollig ACSF wordt verwijderd door te brengen een Kimwipe aan het oppervlak van de spatel en tekening overtollige ACSF uit de buurt van de hersenen. De hersenen zijn zacht naar voren geschoven op de lijm. Het is belangrijk om niet naar de hersenen raken of beneden duwt hem in om het te beveiligen. Het gewicht van de hersenen zelf is meestal voldoende om ervoor te zorgen dat het veilig is. De hersenen en het snijden platform is vervolgens aan de vibrerende microtoom en het snijden goed is gevuld met koud ACSF. De koude oplossing beide bedrijven de hersenen en kan tegen beschadiging te beschermen tijdens het snijden procedure. Verschillende hersengebieden variëren in de mate van kou die kwaliteit schijfjes optimaliseert. De temperatuur van de ACSF voor de voorbereiding van de hypothalamus plakken is over het algemeen 0 ° C. Slices moet langzaam worden gesneden en elk plakje moet vrij kunnen wegdrijven van de hersenen. Als plakjes beginnen te krullen tijdens het snijden, moet de snelheid waarmee het mes is oprukkende worden vertraagd. Men kan gebruik maken van een kleine kwast om uit de krul gaan plakken, maar dit betekent risico beschadiging van de plakjes en dus moet worden vermeden. Langzaam de snelheid van vooruitgang van het blad heeft de voorkeur boven het gebruik van een penseel. Omdat elk plakje wordt gesneden uit het brein, wordt het uit de snij-kamer en geplaatst in een plakje incubatiekamer in een warm waterbad (ongeveer 32 ° C). De slice incubator wordt continu voorzien van zuurstof met behulp van een mengsel van 95% O 2 en 5% CO 2. Over het algemeen, pre-opname slice incubatie varieert van 30 minuten tot 2 uur. Glazen pipetten (3-6 MΩ) zijn vervaardigd, zoals eerder beschreven (9) met behulp van een verticaal trekker. De temperatuur en de duur van het trekken is afhankelijk van de aard van de pipet trekker gebruikt men, het soort glas gebruikt men en de levensduur van de verwarming gloeidraad van de trekker. De vorm van de pipetpunt kan ook variëren afhankelijk van de voorkeur van de gebruiker. We hebben bereikt goed succes met een gelijkmatig conische tip met een opening van 0,1 mm. Grotere openingen in de pipet de neiging om de neuronen beschadigen terwijl de kleinere openingen niet te resulteren in langdurige opnames. Pipetten bedekt met Sylgard om capaciteit te verminderen. Getrokken pipetpunten zijn licht bedekt met Sylgard 184 met een tweede pipet. Sylgarded tips zijn dan warmte-cured met behulp van een warmte kanon. Deze pipetten worden vervolgens gevuld met het bad perfusaat. Ter verhoging van visualisatie van de pipet tips, is een kleine hoeveelheid van de Alexa-568 toegevoegd aan het gedeelte van het bad oplossing worden gebruikt als de pipet oplossing voor het vullen van de pipetten. Wij hebben geen wegen de Alexa-568, maar genoeg te gebruiken om de oplossing roze beurt door oog. De pipet tips kan dan zichtbaar worden onder de Texas rode filter. We hebben een aanpak ontwikkeld om de huidige-clamp opnames te verkrijgen voor de detectie van actiepotentialen met lage weerstand afdichtingen (zie Discussie). Opnames worden uitgevoerd op endogene van de cel rustpotentiaal met 2B zonder toegepaste stroom met behulp van Axon instrument Axoclamp. Echter, door de lage weerstand zegel, kon men niet detecteren actiepotentialen met alleen de 2B versterker. Voor het verhogen van het signaal, is een tweede versterker (AM Systems 3000) gebruikt in serie met de Axoclamp 2B. Deze aanpak heeft het gemak van losse zegels en het nut van de lange termijn opnames. Technisch gezien kan men direct te meten actiepotentialen, waardoor het omzeilen van de problemen met de aanpak in de voltage-clamp opnamemodus (zie Discussie). Men neemt twee pipetten aan het oppervlak van de twee eerder geselecteerde neuronen op hetzelfde moment, op een soortgelijke manier als de aanpak voor de hele cel opname configuratie. Het naderen van beide neurons tegelijkertijd is meer succes in het verkrijgen van de dubbele opnames van te proberen elk neuron van het paar onafhankelijk van elkaar. Gedurende deze tijd zijn de huidige injectie impulsen doorgegeven van de 2B versterker zoals dat ook gebeurt bij de aanpak voor whole-cell opnames. Positieve druk moet worden gehandhaafd op beide pipetten om te voorkomen dat verstopping van de tip. Positieve druk voor dual-opnames is het best gegenereerd door het gebruik van een ongevulde 3 ml lege spuit aan de pipet houder door een lengte van stuk buis. Met behulp van spuiten maakt het mogelijk om te onderhouden de druk op beide pipetten. Positieve druk dient zo snel als de pipet is geplaatst in het bad oplossing van de opname kamer worden toegepast. Een aanpak van de geselecteerde neuronen met de pipetten opeenvolgend. Na het plaatsen van de eerste pipet direct over het grootste oppervlak van het neuron, handhaaft een positieve Bij het verlaten van de spuit op zijn plaats en laat de pipet in deze positie. Men keert terug naar de bovenkant van de opname kamer en verlaagt de tweede opname pipet in de juiste positie. Geselecteerde neuronen worden vaak op verschillende niveaus van de slice. De eerste pipet moet worden geplaatst op het neuron dat diepste in de slice en de positie van de tweede pipet op de meer oppervlakkige neuron. Dit voorkomt dat de positionering van de tweede pipet uit het verschuiven van de positionering van de tweede pipet als de slice zal iets bewegen in het verticale vlak als pipetten voert u het schijfje. Losse zegels (18-30 MΩ) zal worden gebruikt. De positieve druk zal leiden tot een klein kuiltje op het oppervlak van elke cel. Men probeert om de eerste neuron zegel door het vrijgeven van positieve druk en het toepassen van zeer lichte onderdruk. De positieve druk wordt vrijgegeven door het verwijderen van de spuit. Afzuiging via de mond wordt vervolgens toegepast op het vrije uiteinde van de slang. Een gezonde neuron membraan zal snel reageren op de vrijlating van positieve druk en zich houden aan de pipet. Een geringe onderdruk vormt een afdichting met de juiste weerstand in een gezonde neuron. Wanneer men probeert te verzegelen een neuron en faalt, kan de pipet niet opnieuw worden gebruikt, omdat membranen alleen afdichting tot zeer schoon glas. In plaats daarvan, een verhoogt de pipet (en microscoop objectief) uit de buurt van het oppervlak van de slice naar de top van de perfusie goed, verwijdert de pipet uit het bad, verandert in een schone pipet en vervolgens terugkeert naar de slice om te proberen naar een andere cel afdichting . Voor deze reden is het belangrijk om u meerdere mogelijkheden neuronen voor opnamen. Voor de plakjes met minder dan 4-6 opnamekwaliteit neuronen uit te kiezen, het succes bij het verkrijgen van dual-opnames is beperkt. Na de oprichting van een losse afdichting op basis van weerstand, zijn de huidige injectie pulsen van de 2B versterker beëindigd. Het 2B versterker is geplaatst in serie met de 3000-serie versterker. In deze configuratie, de output van de 2B versterker dient als input voor de 3000-serie versterker. De laatste versterker biedt signaal voor de data-acquisitie. De afdichting (stap 4) en herconfiguratie van amplifers (stap 5) wordt vervolgens herhaald voor de tweede neuron. Figuur 1. Een periode van verhoogde vuren in twee GnRH neuronen met behulp van de losse zegel bevestigd opname configuratie in een sagittale slice voorbereiding. De slice is afgeleid van een gecastreerde reu. Elke opwaartse doorbuiging geeft een actiepotentiaal. Merk op dat een GnRH neuron (top sporen) bijna continu branden vertoont, terwijl de tweede GnRH neuron vertoont intermitterende barst. Dit patroon van activiteit van een GnRH-neuronen is vergelijkbaar met die van de afzonderlijke eenheden uit multi-unit opnames tijdens het hormoon in vivo (7). Gelieve Klik hier voor een grotere versie van figuur 1 te zien.