Этот метод был использован в исследованиях сообщается в Бриггс и соавт., Наука 325 (5938). 318-321 (2009) . Реагенты требуется: AmpliTaq Золотой ДНК-полимераза 10x GeneAmp ПЦР буфера II MgCl 2 25 мМ дНТФ микс, 25 мМ каждого БСА, 10 мг-1 мл в воде Молекулярная биология класса воды Е. Б. буфера (поставляется вместе с комплектом MinElute очистки ПЦР); 10 мМ Трис-HCl, рН 8,5 MinElute ПЦР Очистка Kit М-270 стрептавидин Dynabeads 2x Связывание и промыть (BW) буфера (2 М NaCl, 10 мМ Трис-Cl, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0, 0,2% Твин 20) 1x Связывание и промыть (BW) буфер (2x BindWash буфера 2X разбавленный в воде) Горячая промывка (HW) буфер (2,5 мм MgCl, 1X Taq Золото буфера, 0,1% Твин 20) Для производителя информацию о нестандартных реактивов и оборудования см. ниже таблицу. 1) Библиотека усиления ДНК-матрицы здесь 454 библиотеки получают из низкого числа копий ДНК источник, как описано в (Роланд и Hofreiter, 2007a, 2007b) и (Maricic и Pääbo, 2009). Для усиления целую библиотеку, подготовить следующие смеси ПЦР: Реагент мкл на реакцию Воды 45 10X Гена Amp PCR буфера II 10 MgCl 2 (25 мм) 10 BSA (10 мг / мл) 2 дНТФ (25 мМ каждого) 1 454 emPCR FWD primer/10uM 3 454 emPCR РВС primer/10uM 3 AmpliTaq Золотой ДНК-полимераза (5 ед / мкл) 1 454 ДНК библиотеку шаблонов 25 Общий 100 Используйте следующую программу ПЦР в Thermo циклер в течение 14 циклов усиления 95 ° С 12 мин 95 ° C 30-х годов 60 ° C (или желаемого отжига температура) 1 мин 72 ° С 1 мин К 2 (х 13) 72 ° С 5 минут 10 ° C ∞ Purify реакции на спину Qiagen MinElute колонки в соответствии с инструкциями производителя. Элюции в 50 мкл EB буфера. Количественная очищенной усиливается продукта, а также аликвоту неусиленных библиотека с КПЦР (Meyer и соавт., 2007). Если усиленный продукт имеет более чем 1 X 10 12 копий в мкл, уменьшить количество шаблонов на следующем этапе удлинения праймера, чтобы не более 2 х 10 12 копий добавляются реакции удлинения праймера. 2) удлинения праймера Подготовка мастер микс для необходимого количества реакций. Реагент мкл на реакцию Воды 45 10X Гена Amp PCR буфера II 10 MgCl 2 (25 мм) 10 BSA (10 мг / мл) 2 дНТФ (25 мМ каждого) 1 454 emPCR FWD primer/10uM 3 454 emPCR РВС primer/10uM 3 AmpliTaq Золотой ДНК-полимераза (5 ед / мкл) 1 454 ДНК библиотеку шаблонов 25 Общий 100 Выполните следующую программу в Термоциклер для одной реакции удлинения праймера: 95 ° С 12 мин 60 ° C (или ваш УИК грунтовки температура отжига если отличается) 1 мин 72 ° C 5 мин 72 ° C навсегда! Важнейший шаг Держите реакции после расширения при 72 ° C. Затем непосредственно пипеткой 150ul PBI или PB буфер для QIAGEN MinElute очистки в трубы перед снятием с огня блока. Это очень важно, чтобы избежать неспецифических праймеров отжига и захватить как смесь остынет. Purify реакции на спину колонке Qiagen MinElute, в соответствии с инструкциями производителя. Элюции в 50 мкл EB. 3) расширение продукта Capture Ресуспендируют исходного раствора М-270 бусин на вортексе. Выньте 25 мкл суспензии в шарик образца. Вымойте бисером дважды 500ul 2x BW буфера и ресуспендируют в 25 мкл буфера 2xBW на образец. Добавить 25 мкл элюата с шага от 2,3 до 25 мкл бусинка подвески с шага 3.1. Смешать затем поверните на 15 мин при комнатной температуре. Рекомендуемые: сохранить оставшиеся 5 мкл элюата с шага 2.3 для количественного КПЦР. Передача всей смеси по 1,5 мл свежей трубки (это помогает уменьшить унос нецелевых фрагментов библиотеки). Гранул супернатант использованием магнитных частиц коллектор (ПДК) и отбросить супернатант. Промыть 5 раз с 500 мкл буфера 1xBW (многие моет помочь удалить как можно больше фона, как это возможно). После последней промывки, спин вниз кратко и удалить последние следы супернатант. Добавить 500 мкл 1x Горячая промывка (HW) буфера. Встряхните в течение 2 мин при 65 ° С (или выше 5C УИК грунтовки Tm) на тепловых блоков. Удалить супернатант быстро после этого, чтобы свести к минимуму охлаждение. (Этот шаг заключается в удалении фона фрагменты сих пор ассоциируется с УИК грунтовки, но фактически не продлен во время расширения шаг). Удалить последние следы супернатант. Ресуспендируют бусинка гранул в 30 мкл буфера EB. Передача всей смеси по 1,5 мл свежей трубки (это помогает уменьшить унос нецелевых фрагментов библиотеки). Инкубировать при 95 ° С в течение 3 минут в термоциклер для элюирования. Место в MPC и удалить супернатант, заботясь, чтобы оставить позади бисером. 4) Захват продуктов амплификации Подготовка смеси ПЦР-мастера для необходимого количества образцов. Реагент мкл на реакцию Воды 45 10X Гена Amp PCR буфера II 10 MgCl 2 (25 мм) 10 BSA (10 мг / мл) 2 дНТФ (25 мМ каждого) 1 454 emPCR FWD primer/10uM 3 454 emPCR РВС primer/10uM 3 AmpliTaq Золотой ДНК-полимераза (5 ед / мкл) 1 Элюировали продукта захвата 25 Общий 100 Используйте следующую программу ПЦР в Thermo циклер для усиления 14 циклов: 95 ° С 12 мин 95 ° C 30-х годов 60 ° C (или желаемого отжига температура) 1 мин 72 ° С 1 мин К 2 (х 13) 72 ° С 5 минут 10 ° C ∞ Purify реакции на кремний Qiagen колонке спина MinElute в соответствии с инструкциями производителя. Элюции в 50 мкл буфера EB. Продукт можно теперь использовать как для второго тура захвата, начиная с шага 2.1, или вводятся непосредственно в 454 эмульсии ПЦР протокол, для секвенирования. Представитель Результаты: Настоятельно рекомендуется, когда начинали с УИК протокола для выполнения первой реакции захвата, где небольшое количество "положительной последовательности целевого управления» (например, ~ 100bp ПЦР-продукта – 1 пикограмм достаточно легко) смешивается с нормальным рекомендуется Сумма усиленного 454 библиотека шаблонов (см. шаг 2.1), и захват осуществляется с одного праймера УИК предназначены для улавливания положительного контроля продукции. Если этот контроль осуществляется реакция, КПЦР как с положительным контролем конкретных и 454 адаптер конкретной пары праймеров может быть использована для определения количества «контроль целевого" по сравнению с фоном в очищенной реакции удлинения праймера (1,3), продукт удлинения праймера (2,3 ) и элюировали бусинка продукта захвата (3,6). Таким образом, как эффективность удаление фона ("специфичность") и эффективности целевых восстановления ("чувствительность") в экспериментальных условиях могут быть непосредственно измерены. Успешное УИК протокола обычно имеет следующие свойства – Чувствительность (измеряется количество контроля целевого сохранил через протокол): Общая сумма целевого элемента управления в элюировали бусинка продукта захвата (3,6) = ~ 1-20% от общей суммы в очищенной удлинения праймера реакции (2,3). Фон (измеряется 454 пары праймеров emPCR): Общая сумма фон в элюировали бусинка продукта захвата (3,6) <0,01% от общей суммы в очищенной реакции удлинения праймера (2,3). Если есть менее 1% от целевого показателя, оставшихся в конечном продукте, шаг удлинения праймера, возможно, был неудачным, и должны быть расследованы. Если есть гораздо больше, чем 0,01% от фона, оставшихся в готовой продукции, промывки, возможно, были неправильно выполнены и должны быть расследованы.