Un nuovo mezzo per misurare la neurotrasmissione otticamente con analoghi della dopamina fluorescenti.
Il sistema nervoso trasmette i segnali tra i neuroni attraverso il rilascio dei neurotrasmettitori durante la fusione delle vescicole sinaptiche. Per osservare l'assorbimento e il rilascio dei neurotrasmettitori dai singoli terminali presinaptici direttamente, abbiamo progettato fluorescenti falsi neurotrasmettitori come substrato per il trasportatore della vescicole sinaptiche monoamine. L'utilizzo di questi sonde per il rilascio di dopamina nello striato immagine, abbiamo fatto alcune osservazioni pertinenti alla plasticità sinaptica. Abbiamo trovato che la frazione delle vescicole sinaptiche per il rilascio dei neurotrasmettitori stimolo era dipendente dalla frequenza dello stimolo. Un cineticamente distinte popolazione "riserva" delle vescicole sinaptiche non è stata osservata in queste condizioni sperimentali. Una frequenza dipendente dalla eterogeneità dei terminali presinaptici stato rivelato che era dipendente in parte sui recettori della dopamina D2, che indica un meccanismo per dipendente dalla frequenza di codifica di selezione presinaptico.
Hui Zhang e Niko gubernator G. contribuito in maniera uguale a questo lavoro.
In questo video, dimostriamo un metodo per visualizzare neurotrasmissione otticamente con analoghi della dopamina fluorescenti. FFN511 è la prima generazione di FFNs abbiamo sviluppato. Anche se è stato progettato prendendo di mira i neuroni trasportatore vescicolare delle monoamine (VMAT2) che porta neurotrasmettitori monoamine dal citoplasma in vescicole sinaptiche, e le etichette in particolare i terminali della dopamina nello striato e catecolamine presunta e / o terminali della serotonina nella corteccia (come mostrato nella Scienza carta), un periodo di carico appropriata è fondamentale per la specificità in quanto è relativamente FFN511 idrofobo. Abbiamo scoperto che l'incubazione per più di 40 minuti si tradurrà in ampi colorazione aspecifica a fette dello striato. La specificità può essere direttamente determinato da decolorazione con un'alta concentrazione di KCl, che dovrebbe causare il rilascio di FFN all'interno funzionale vescicole sinaptiche. L'esposizione della fetta di FFN511 per meno di 15 minuti si tradurrà in debole segnale fluorescente a causa del carico insufficiente del colorante nei terminali. In questo protocollo, utilizziamo 100μM ADVASEP-7 per rimuovere il colorante legato al tessuto extracellulare. Questo passaggio non è necessario, ma se è omesso, il tempo di washout in ACSF deve essere prolungata. In sintesi, a seconda della preparazione si è scelto, sarà necessario modificare il periodo di concentrazione e di carico per determinare l'etichettatura ottimale.
The authors have nothing to disclose.
D. Il Sames grazie Harold G. & Leila Y. Mathers Charitable Foundation e della Columbia University Iniziative in Scienze e Ingegneria.
D. Sames e D. Sulzer ringraziare la Fondazione McKnight per le innovazioni tecnologiche nel McKnight Premio Neuroscienze
D. Sulzer grazie NIDA, NIMH, e il Picower e Fondazioni Malattia di Parkinson.
H. grazie Zhang NARSAD.
RH Edwards ringrazia la Michael J. Fox Foundation, la National Parkinson Foundation, NIDA e NIMH.
Ringraziamo Robert Burke per 6-OHDA iniezioni e consulenza, Sonders Marchio di discussione utile, Merek Siu per la programmazione di analisi delle immagini, e Jan Schmoranzer per l'assistenza tecnica con l'installazione di microscopia TIRF.
Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
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FFN511 (8-(2-Amino-ethyl)-2,3,5,6-tetrahydro-1H,4H-11-oxa-3a-aza-benzo[de]anthracen-10-one) | Dalibor Sames’s laboratory at Columbia University | |||
ADVASEP-7 | CyDex, Overland Park, KS | AR-OA7-005 | ||
RC-27L Recording chamber | Warner Instrument | 64-0375 | ||
PELCO PrepEze 6-Well Holder | Ted Pella, Inc. | 36157-1 | For slice incubation | |
Master-8 pulse stimulator and Iso- Flex stimulus isolator | AMPI, Jerusalem, Israel |