Génération de cellules souches pluripotentes induites par la reprogrammation des fibroblastes humains avec les lentivirus TF Stemgent Homme Set

1. Reprogrammation Cellules BJ semences à une densité de 1 x 10 5 cellules par puits d'une plaque à 6 puits. Culture des cellules dans 2 ml de milieu de croissance (450 ml EMEM supplémenté avec 50 ml de FBS ES qualifié, 5 ml 10 mM non acides aminés essentiels, 5 ml de pénicilline / streptomycine, 5 ml de 200 mM de L-glutamine et 0,9 ml β 55 mm -mercaptoéthanol) nuit à 37 ° C et 5% de CO 2. Le même jour, commencer à préparer les plaques d'alimentation du MEF en ajoutant 0,1% de gélatine diluée dans de l'eau sur une plaque de 6 puits et incuber pendant une nuit à 37 ° C et CO 2 5%. Après incubation, éliminer le milieu à partir des cellules BJ et ajouter 2 ml milieu de croissance complété avec 6 pg / ml de polybrène, 500 ul hOct4-lentivirus, 50 ul hSox2-lentivirus, 50 ul hNanog-lentivirus et 50 pi hLin28-lentivirus dans chaque puits . Secouez doucement la plaque pour assurer un revêtement uniforme du milieu. Incuber une nuit à 37 ° C et CO 2 5%. Le même jour, enlever 1 flacon de cellules MEF FC-1 de l'azote liquide et de dégel. Retirer le liquide des puits de gélatine enduit (voir étape 1.2) et ajouter des cellules nourricières du MEF à une densité de 0,2 x 10 5 cellules / puits. Le volume total par puits devrait être 2ml de cellules dans un milieu de croissance du MEF (450 ml de DMEM supplémenté avec 50 FBS ml et 5 ml non acides aminés essentiels). Le lendemain, détachez les cellules BJ avec 0,05% de trypsine / EDTA et centrifuger à 200 xg pendant 5 minutes. Aspirer le moyen et remettre en suspension dans un milieu de croissance. Retirer de la plaque de support chargeur de MEF (voir étape 1.4) et ajouter 2 ml / puits de la suspension cellulaire BJ. La concentration des cellules devraient être d'environ 5 x 10 4 cellules / puits. Incuber une nuit à 37 ° C et CO 2 5%. Remplacer moyenne 24 heures après le réensemencement avec des humains ES / IPS milieu de culture cellulaire (400 ml DMEM/F12 supplémenté avec 100 ml de sérum de remplacement Knockout, 5 ml 10 mM non acides aminés essentiels, 5 ml de 200 mM de L-glutamine, 0,9 ml 55 mM β-mercaptoéthanol et 20 ng / ml de bFGF humain recombinant). Changer moyenne toutes les 24 heures pendant 7 jours. Après sept jours, le changement moyen du MEF milieu conditionné (voir section 2). 2. Préparation du MEF milieu conditionné Graine FC-1 des cellules nourricières du MEF à 2 x 10 5 cellules / puits sur une plaque à 6 puits dans 2 ml de milieu de croissance du MEF. Incuber une nuit à 37 ° C et CO 2 5%. Changement moyen humaines ES / IPS milieu de culture cellulaire. Incuber une nuit à 37 ° C et CO 2 5%. Recueillir le surnageant toutes les 24 heures pendant quatre jours. Filtrer le surnageant à travers un filtre de 0,22 um. Supplément surnageant avec 50 ng / ml de bFGF. 3. Sélection Colony iPS et repiquage Sélectionnez une colonie ES-like et réensemencer en milieu de culture humaine ES / IPS complété avec 10 pM de Stemolecule Y27632 sur des boîtes de culture de cellules pré-ensemencés avec des CF-1 des cellules nourricières du MEF. Incuber une nuit à 37 ° C et CO 2 5%. Changer le milieu de culture toutes les 24 heures pour les sept premiers jours (sans complétant avec Stemolecule Y27632). Après sept jours, le changement moyen du MEF milieu conditionné (voir section 2 pour la préparation). Nous avons continué repiquage des cellules jusqu'à ce qu'elles montrent la morphologie typique ES humaines. 4. Examen des marqueurs immunocytochimiques pluripotence Lavez délicatement les cellules trois fois avec PBS. Fixer les cellules avec 500 pi de fixateur pendant 20 minutes à température ambiante. Lavez délicatement les cellules trois fois avec PBS. Bloc de fixation non spécifique avec 500 ul du tampon de blocage pendant une heure à température ambiante. Incuber les cellules avec 250 pi de l'anticorps primaire spécifique nuit à 4 ° C (nous avons utilisé TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4, SSEA-3, Oct4, Sox2, Nanog et Lin28 au 1:100 dilutions). Lavez délicatement les cellules trois fois avec PBS. Incuber les cellules avec 250 pi d'anticorps secondaire pendant 1 heure à température ambiante, en gardant loin de la lumière (nous avons utilisé chèvre anti-souris conjugué IgM Cy3, de chèvre anti-IgG de souris conjugué Cy3, chèvre anti-rat IgM Cy3 conjugué et de chèvre anti- Lapin Cy3 conjugué au 1:300 dilutions). Lavez délicatement les cellules trois fois avec PBS. Ajouter DAPI (concentration finale 1 ug / ml) pour le dernier lavage et incuber 5 minutes à visualiser les noyaux. Analyser les cellules sous grossissement. Partie 5: Résultats Représentant 1. Résultats Morphologie: L'homme le prépuce fibroblastes (BJ), les cellules ont été co-transduites avec Oct4, Sox2, Nanog, et Lin28. Les modifications morphologiques ont été observées dès le jour 4 post-transduction, et les amas de cellules sont devenues plus serrées au jour 17 (figure 1). Des colonies ont été cueillis à la main 25 jours et cultivés sur FC-1 des cellules nourricières du MEF. Afin de faciliter la formation iPS colonie cellulaire après reprogrammation, nous avons utilisé Stemolecule Y27632, Un inhibiteur de ROCK, pour l'ensemencement initial nuit lors de chaque passage. colonies de cellules iPS avec une bonne morphologie ont été observées après trois cycles séquentiels de la colonie de la cueillette et repiquage. 2. Expression de marqueurs pluripotence: Afin de mieux caractériser les cellules iPS colonies isolées, nous avons examiné pour la présence de marqueurs communs pluripotence exprimé dans les cellules ES. Les colonies présentaient une forte phosphatase alcaline (AP) activité (figure 2). Par ailleurs, l'immunocytochimie (ICC) a été réalisée sur les colonies de cellules iPS avec un panel d'anticorps marqueurs spécifiques pluripotence, y compris les marqueurs de surface TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4 et SSEA-3 ainsi que des marqueurs nucléaires Oct4, Sox2 et Nanog. Les colonies isolées iPS ont été positifs pour tous les marqueurs (figure 3). Les résultats de la CPI montrent que les cellules iPS exposées du motif de la pluripotence appropriée l'expression du marqueur, ce qui démontre que ces cellules iPS ressemblent indifférencié des cellules ES humaines. Figure 1: Les modifications morphologiques des cellules transduites BJ. Images en champ clair d'une colonie de cellules iPS typiques formé en (A) 4 jours et (B) 17 jours après la transduction. Figure 2: Activité de l'AP reprogrammé les cellules BJ. Trois différentes colonies colorées à Stemgent Kit Phosphatase Alcaline coloration. Figure 3: Les cellules iPS humaines expriment des niveaux élevés des marqueurs de cellules ES suivantes spécifiques: les marqueurs de surface TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4 et SSEA-3, et des marqueurs nucléaires 4 oct. Nanog et Sox2.