A ultracentrífuga analítica (AUC) célula de amostra detém amostra e tampão de referência e durante as experiências e é exposto a alto vácuo e velocidades de rotor até 60.000 rpm. Este vídeo vai demonstrar a atenção rigorosa ao pormenor necessário para o carregamento, montagem e alinhamento deste componente muito importante de um experimento AUC.
A ultracentrífuga analítica (AUC) é uma ferramenta poderosa biofísicos que nos permite gravar perfis de sedimentação macromolecular durante a centrifugação de alta velocidade. Quando devidamente planejado e executado, uma velocidade de sedimentação AUC ou experiência de equilíbrio de sedimentação pode revelar muito sobre uma proteína em relação ao tamanho e forma, a pureza da amostra, coeficiente de sedimentação, afirma oligomerização e interações proteína-proteína.
Esta técnica, entretanto, requer um nível de atenção rigorosa técnica. Células da amostra segurar um pedaço centro sectored imprensado entre dois conjuntos janela. Eles são selados com uma pressão de torque de cerca de 120-140 in / lbs. Tampão de referência e amostra são carregados para os setores central e, em seguida, após a selagem, as células são precisamente alinhados em um rotor de titânio para que os sistemas de detecção óptica digitalizar ambos amostra e tampão de referência na linha média mesmo caminho radial através de cada setor central enquanto roda em velocidades de até 60, 000 rpm e sob vácuo muito alto
Não só é a montagem de células de amostra adequada crítica, componentes de célula de amostra são muito caros e devem ser devidamente tratados para garantir que eles estão em ótima condição de trabalho, a fim de evitar vazamentos e quebras durante as experiências. Lidar com janelas com cuidado, pois mesmo a menor rachadura ou arranhão pode levar à quebra na centrífuga. O contato entre central e janelas devem ser tão apertada quanto possível; anéis ou seja, sem Newton s deve ser visível após a pressão torque é aplicado. Poeira, fiapos arranhões e óleos sobre o Windows ou o centro todo compromisso esse contato e pode muito facilmente levar ao vazamento de soluções de um setor para outro ou vazamento para fora do centro todos juntos. Não são apenas amostras preciosas perdidas, vazamento de soluções durante um experimento irá causar um desequilíbrio de pressão na célula que muitas vezes leva a janelas quebradas e centerpieces. Além disso, juntas plug and plugs de habitação deve ser firmemente no lugar para evitar soluções que está sendo retirado do setor central através dos orifícios de carga pelo alto vácuo na câmara de centrifugação. Liners janela e juntas devem estar livres de quebras e rachaduras que poderiam causar o movimento, resultando em janelas quebradas.
Este vídeo vai demonstrar os nossos procedimentos de montagem de célula de amostra, a carga de torque e alinhamento do rotor para ajudar a minimizar danos aos componentes, a solução de vazamentos e quebras durante o experimento AUC perfeito.
O conjunto de células adequada, a inserção da amostra, e alinhamento de células no rotor é fundamental para experimentos de alta qualidade AUC. Isso é verdade, em particular, para experimentos que requerem uma análise muito detalhada dos dados adquiridos nos perfis de sedimentação macromolecular, por exemplo, ao estudar as interações proteína e determinação montantes agregados de rastreio. Muitas vezes a qualidade da montagem experimental é limitante para a exatidão e precisão dos resultados do estudo AUC. Para detalhes sobre o design prático e posterior execução de experimentos AUC, ver Referências 1-3. Workshops cobre a configuração prática, teoria e análise de dados de experimentos AUC estão sendo realizadas duas vezes por ano em nosso laboratório no Instituto Nacional de Saúde [4].
Agradecemos o apoio de pesquisa pelo Programa de Pesquisa Intramural de NIBIB, NIH.
Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
4-place Ti analytical rotor | Beckman Coulter | 361964 | ||
Torque stand assembly | Beckman Coulter | 361318 | ||
Cell alignment tool | Beckman Coulter | 362340 | ||
Spinkote Lubricant | Beckman Coulter | 306812 | ||
Counterbalance | Beckman Coulter | 360219 | ||
Cell Housing kit | Beckman Coulter | 334602 | ||
Window gasket | Beckman Coulter | 327021 | ||
Window liner | Beckman Coulter | 362329 | ||
Window, sapphire | Beckman Coulter | 307177 | ||
Window, quartz | Beckman Coulter | 301730 | ||
Window holder | Beckman Coulter | 305037 | ||
12mm double sector Epon centerpiece | Beckman Coulter | 306493 | ||
Cell plug gaskets | Beckman Coulter | 327022 | ||
Cell housing plug | Beckman Coulter | 362327 |