L'ultracentrifugation analytique (AUC) de cellules de l'échantillon et le tampon de l'échantillon détient référence et au cours d'expériences et est exposé à vide élevé et des vitesses de rotor jusqu'à 60.000 rpm. Cette vidéo va démontrer le souci du détail nécessaire pour l'assemblage, le chargement et l'alignement de cette composante très importante d'une expérience ASC.
L'ultracentrifugation analytique (AUC) est un outil puissant biophysiques qui nous permet d'enregistrer des profils de sédimentation macromoléculaires pendant la centrifugation à grande vitesse. Lorsqu'il est correctement planifié et exécuté, une vitesse de sédimentation ou de l'expérience ASC équilibre de sédimentation peut révéler beaucoup de choses sur une protéine en ce qui concerne la taille et la forme, la pureté de l'échantillon, coefficient de sédimentation, les Etats oligomérisation et interactions protéine-protéine.
Cette technique, cependant, exige un niveau d'attention rigoureuse technique. Exemple de cellules détenir une pièce maîtresse sectorisé en sandwich entre deux assemblées fenêtre. Ils sont scellés avec une pression d'environ 120-140 couple in / lbs. Tampon de référence et l'échantillon sont chargés dans les secteurs central et puis après d'étanchéité, les cellules sont alignées avec précision dans un rotor en titane afin que les systèmes de détection optique de balayage à la fois l'échantillon et le tampon de référence dans la ligne médiane trajet radial même à travers chaque secteur central tout en tournant à des vitesses allant jusqu'à 60 000 tours par minute et sous vide très poussé
Non seulement est bon assemblage de cellules de l'échantillon critiques, composants de la cellule de l'échantillon sont très chers et doivent être correctement pris en charge afin de s'assurer qu'ils sont en état de marche optimal afin d'éviter les fuites et les bris lors des expérimentations. Manipuler les fenêtres soigneusement, pour la moindre fissure ou éraflure peut conduire à la rupture dans la centrifugeuse. Le contact entre centre et fenêtres doivent être aussi serrée que possible, c'est à dire les anneaux de Newton ne s doit être visible après une pression de couple est appliqué. La poussière, les peluches, les rayures et les huiles soit sur les fenêtres ou la pièce maîtresse tout compromis ce contact et peut très facilement conduire à des fuites de solutions d'un secteur à un autre ou une fuite hors de la pièce tous ensemble. Non seulement les précieux échantillons perdus, les fuites de solutions lors d'une expérience va provoquer un déséquilibre de pression dans la cellule qui conduit souvent à des vitres brisées et maîtresses. En outre, les joints et bouchons branchez le logement doit être solidement en place pour éviter les solutions étant retirée du secteur de la pièce à travers les trous de chargement par le haut vide dans la chambre de centrifugation. Doublures de fenêtres et les joints doivent être exempts de ruptures et les fissures qui pourraient causer des mouvements qui en résultent vitres brisées.
Cette vidéo va montrer nos procédures d'assemblage de cellules de l'échantillon, le couple, le chargement et l'alignement du rotor pour aider à minimiser les dommages composante, la solution de fuites et de bris lors de l'expérience parfaite AUC.
L'ensemble de la cellule appropriée, l'insertion de l'échantillon, et l'alignement des cellules dans le rotor est critique pour haute expériences ASC qualité. Cela est vrai, en particulier, pour des expériences qui nécessitent une analyse très détaillée des données acquises sur les profils de sédimentation macromoléculaires, par exemple, lorsque l'on étudie les interactions entre protéines et de déterminer les montants globaux de trace. Souvent, la qualité de l'installation expérimentale est la limitation de l'exactitude et la précision des résultats de l'étude des AUC. Pour plus de détails sur la conception pratique et l'exécution des expériences d'autres AUC, voir Références 1 – 3. Ateliers pratiques couvrant l'installation, la théorie et l'analyse de données d'expériences AUC sont détenus deux fois par an dans notre laboratoire à l'Institut National de la Santé [4].
Nous reconnaissons l'appui à la recherche par le Programme de recherche intra-muros des NIBIB, NIH.
Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
4-place Ti analytical rotor | Beckman Coulter | 361964 | ||
Torque stand assembly | Beckman Coulter | 361318 | ||
Cell alignment tool | Beckman Coulter | 362340 | ||
Spinkote Lubricant | Beckman Coulter | 306812 | ||
Counterbalance | Beckman Coulter | 360219 | ||
Cell Housing kit | Beckman Coulter | 334602 | ||
Window gasket | Beckman Coulter | 327021 | ||
Window liner | Beckman Coulter | 362329 | ||
Window, sapphire | Beckman Coulter | 307177 | ||
Window, quartz | Beckman Coulter | 301730 | ||
Window holder | Beckman Coulter | 305037 | ||
12mm double sector Epon centerpiece | Beckman Coulter | 306493 | ||
Cell plug gaskets | Beckman Coulter | 327022 | ||
Cell housing plug | Beckman Coulter | 362327 |