Depletion spezifischer Zellpopulationen durch Ergänzung Depletion

Die Reinigung von Zellpopulationen ist ein gemeinsames Verfahren für die Untersuchung ihrer Funktionen erforderlich. Hier beschreiben wir eine schnelle und effektive Methode zum Abbau Zellpopulationen mit Antigen-spezifischen Antikörpern und Komplement Erschöpfung. Die Erschöpfung von Zellpopulation kann erreicht werden, wenn eine Ergänzung aktivierende Antikörper zur Verfügung, um eine Linie spezifischer Marker werden. Hier haben wir die Depletion von T-Zellen unter Verwendung eines mAb spezifisch für Thy1 gezeigt, äußerte ein Protein im Wesentlichen alle T-Zell-Populationen. Wir erschöpft über 95% der αβ T-Zellen und die restlichen Splenozyten wurden von 68% auf 98% erhöht. Dieser Grad an Reinheit der Zellen ist vergleichbar mit anderen Reinigungsverfahren Strategien einschließlich FACS und Magnetic Bead Separation. Ergänzung Erschöpfung ist eine schnelle Technik, die in 1,5 Stunden durchgeführt werden kann, wenn die Start-Zell-Population entsteht. Ein weiterer Vorteil der Ergänzung Erschöpfung ist, dass jedes Labor kann die Technik durchzuführen, weil es nicht erfordern teure Geräte und Reagenzien. Der einzige große Teile der Ausrüstung erforderlich sind, einem Wasserbad und einer Zentrifuge. Kaninchen ergänzen können aus einer Vielzahl von Anbietern zu einem angemessenen Preis erworben werden (siehe Tabelle der Reagenzien) und viele mAb kann von ATTC erworben werden und lokal zur Kostenkontrolle gewachsen. Im Gegensatz dazu erfordert FACS einem Durchflusszytometer mit cell sorting Kapazität, die in den sechs Zahlen und teuer fluoreszenzmarkierten mAb kosten wird. Magnetic Bead Separation ist preisgünstig, sondern erfordert den Kauf eines Magneten und magnetische Kügelchen, die teuer werden kann. Darüber hinaus sind einige Magnetic Bead Separation Strategien erfordern auch den Kauf von Spalten.

Das größte Hindernis für die Verwendung von Komplement für Zell-Depletion ist die Verfügbarkeit von Komplement aktivierende mAb mit der Antigen-Spezifität erforderlich. Obwohl von Mensch, Maus und Ratte-Antikörper alle die Fähigkeit, zu ergänzen fix haben, sind einige Isotypen besser als andere. Obwohl IgM aus allen drei Arten ist sehr effektiv bei der Befestigung ergänzen die IgG-Isotypen variieren. So kann jeder mAb muss zunächst in einer Pilotstudie getestet werden, um ihre Wirksamkeit zu bestimmen. Für Antikörper, die nicht sehr effizient, kann zwei Runden ergänzen Erschöpfung ohne Auswirkungen auf die Rentabilität der übrigen Zellpopulationen durchgeführt werden. Als Kosteneinsparungen sollten die Antikörper für eine optimale Wirksamkeit titriert werden. Hinzu kommt, dass die verwendeten Antikörper nicht nötig, gereinigt werden. Hybridomüberstände und Aszites-Flüssigkeit arbeiten genauso effektiv, was besonders praktisch ist, IgM-Antikörper, die schwer zu reinigen sind. Wie mit den Antikörpern, ist es unerlässlich, dass die Ergänzung in einer Pilotstudie titriert werden. Eine zu hohe Konzentration führt zum Verlust der Lebensfähigkeit von nicht gezielten Zellpopulationen führen. Wichtig ist auch, dass die Inkubationszeit nicht mehr als 60 Minuten.

In unserem Protokoll haben wir Co-Inkubation der Antikörper und das Komplementsystem zusammen. Allerdings können die Zellen mit dem Antikörper für 15-30 Minuten zu kennzeichnen und gewaschen vor der Zugabe von Komplement. Wenn Sie diese Strategie, stellen Sie sicher an den Antikörper Inkubationen auf Eis, um den Verlust der Zell-Antigen auf der Zelloberfläche zu verhindern durchzuführen, wie dies bei einigen Proteinen durch Patching und Capping oder Rezeptor-Internalisierung. Obwohl hocheffiziente, ist der größte Nachteil bei Erschöpfung Ergänzung zu anderen Methoden verglichen, dass es nicht zur positiven Selektion verwendet werden. So ist es schwierig, Subpopulationen von Zellen zu erhalten. Zum Beispiel würde es schwierig sein, Randzone B-Zellen aus follikulären B-Zellen, die am besten durch FACS erfolgen würde zu reinigen. In dieser Situation könnte die Komplementaktivierung verwendet werden, um T-Zellen führen, um die Anzahl der Zellen, die sortiert reduzieren. Diese Strategie würde die Art der Zeit, die würden Geld sparen und wäre weniger hart auf die Zellen.

Da die Aufreinigung von spezifischen Zellpopulationen ist eine häufige Anforderung eine Reihe von Strategien entwickelt worden. Die wichtigsten Vorteile des Komplementsystems Erschöpfung Strategie sind die Erschwinglichkeit, technische Einfachheit und Zeitersparnis.