Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte da Riprogrammazione fibroblasti embrionali di topo con un fattore quattro trascrizione, Doxiciclina inducibile lentivirali sistema di trasduzione

<p class="jove_title"> 1. Trasduzione virale di MEF</p><ol><li> Il giorno prima di iniziare l'esperimento, cappotto una cella di 15 centimetri piatto cultura con lo 0,2% di gelatina sterile filtrata in DDH₂ O. Incubare la piastra una notte a 37 ° C e 5% di CO₂.</li><li> Aspirare il liquido dal piatto rivestito di gelatina, e le cellule MEF seme (che abbiamo usato Nanog-GFP/rtTA cellule MEF) ad una densità di 4×10⁵ Cellule per piatto. Incubare le cellule in 30 ml di mezzo di crescita MEF (450ml DMEM integrato con 50 FBS ml, 5 ml 100x aminoacidi non essenziali, 5 ml di penicillina / streptomicina, 5 ml di 200 mM L-glutammina e 0,5 ml 55mm β-mercaptoetanolo) per due giorni di CO a 37 ° C e 5%₂ Fino a circa l'80% confluenti.</li><li> Aspirare il medio e aggiungere 30 ml di mezzo di crescita MEF integrato con lentivirus concentrato (4 x 100 ul soluzione madre virus + 29,6 ml di terreno di coltura). Rock the piatto delicatamente per garantire una distribuzione uniforme del mezzo. Incubare le cellule durante la notte a 37 ° C e 5% di CO₂.</li></ol><p class="jove_title"> 2. Doxiciclina indotta Riprogrammazione</p><ol><li> 20-24 ore dopo la trasduzione, trypsinize le cellule trasdotte, centrifuga a 200 xg per 5 minuti e risospendere in ES / IPS terreno di crescita (450 ml Knockout DMEM integrato con 50 ml di cellule ES-qualificati siero di vitello, 5 ml di penicillina / streptomicina, 5 ml di 200 mM L-glutammina, 0,5 ml β-mercaptoetanolo e 25 microlitri LIF). Seed trasdotte MEF ad una concentrazione adeguata per la dimensione della parabola coltura cellulare (abbiamo usato 2,5 x 10⁵ Celle per 10 cm per piatto riprogrammazione esperimenti efficienza e l'isolamento colonia, e 2 x 10⁴ Cellule per bene in 4 piatti e per gli esperimenti ICC). Incubare per una notte di CO a 37 ° C e 5%₂. Nota: tutte le cellule trasdotte restanti possono essere congelati in azoto liquido per le analisi future.</li><li> Aspirare il mezzo e sostituirlo con ES / IPS terreno preparato fresco e integrato con doxiciclina per una concentrazione finale di 2 mg / ml (abbiamo aggiunto anche mezzo senza DOX come controllo negativo). Incubare a 37 ° C e CO 5%₂.</li></ol><p class="jove_title"> 3. Analisi immunocitochimica di efficienza di trasduzione</p><p class="jove_content"> 48 ore dopo l'induzione doxiciclina, determinare l'efficienza di trasduzione di immunoistochimica (ICC). Effettuare test sulle cellule ICC saltuariamente in 4 piatti bene. Tutti i volumi sono elencati nella seguente protocollo deve essere regolata in base alle dimensioni piastra di coltura cellulare.</p><ol><li> Lavare delicatamente le cellule una volta con PBS (senza Mg^{2 +} + O Ca^{2 +}).</li><li> Fissare le cellule con 500 microlitri di 0.5 ml di paraformaldeide 4% in PBS per 15 minuti a temperatura ambiente.</li><li> Lavare delicatamente le cellule due volte con PBS.</li><li> Permeabilize cellule aggiungendo 500 ml di ghiaccio freddo 0,2% Tween ® -20 in PBS. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.</li><li> Lavare delicatamente le cellule due volte con PBS.</li><li> Blocco legame non specifico con 200 microlitri di buffer bloccando per un'ora a temperatura ambiente.</li><li> Incubare le cellule con 200 l di anticorpi specifici primario overnight a 4 ° C (abbiamo usato Oct4, Klf4, Sox2, c-Myc).</li><li> Lavare delicatamente le cellule due volte con PBS.</li><li> Incubare le cellule con 200 l di anticorpo secondario per 1 ora a temperatura ambiente, proteggere le piastre dalla luce (abbiamo usato Donkey anti-coniglio coniugato Rodamina, Donkey anti-capra coniugato AlexaFluor ® 594, Donkey anti-mouse coniugato rodamina e Donkey contro -Coniglio Rhodamine coniugato).</li><li> Lavare delicatamente le cellule due volte con PBS.</li><li> Aggiungi DAPI (concentrazione finale 2 mg / ml in PBS) e incubare 10 minuti per visualizzare nuclei.</li><li> Lavare delicatamente le cellule con PBS.</li><li> Aggiungi anti-sbiadimento Aqua-Mount prima immagine utilizzando un microscopio invertito a fluorescenza.</li></ol><p class="jove_title"> 4. Isolare ed espandere cellule iPS Colonie</p><ol><li> Dopo l'avvio del processo di riprogrammazione (come descritto al punto 2), monitorare le culture e sostituire media ogni 48 ore. Abbiamo usato medio contenente doxiciclina per coltivare le cellule per i primi dodici giorni e poi successivamente rimosso doxiciclina dal mezzo per garantire che le colonie iPS manualmente scelto per l'espansione sarebbe DOX indipendente.</li><li> Le cellule devono essere monitorati giorno per cambiamenti morfologici indicativi del processo di riprogrammazione, o quando si usano le cellule come Nanog-GFP/rtTA MEF, morfologia monitorare e fluorescenza GFP per identificare colonie riprogrammato. Ogni esperimento sarà diverso, ma le colonie sono in genere abbastanza grandi per l'isolamento tra i 16 ei 22 giorni. Colonie identificate durante questo lasso di tempo può essere manualmente isolati e trypsinized per l'espansione e l'analisi.</li><li> Il giorno prima di isolare e trypsinizing le colonie riprogrammati, preparare una 24-pozzetti di semina con gamma-irradiati alimentatore strato MEF ad una densità di 5 x 10⁴ Cellule per pozzetto. Incubare per una notte di CO a 37 ° C e 5%₂.</li><li> Scegliere manualmente ogni colonia iPS e trypsinize dissociare gli aggregati di cellule. Re-piastra le cellule iPS in ES / IPS di medie singoli pozzetti del 24 pozzetti pre-seminato con gamma-irradiati alimentatore strato MEF. Pozzetti devono essere seminate ad una densità di 2 x 10⁵ Cellule / pozzetto. Incubare a 37 ° C e CO 5%₂. Modificare i media ogni 24 ore.</li><li> Monitor colonie iPS quotidianamente per la crescita e la fluorescenza GFP. Noi incubare le nostre culture per 6 giorni prima passaging.</li><li> Determinare quali pozzi del 24-pozzetti sono uniformemente esprimono GFP. Pozzi che hanno buona espressione GFP può essere trypsinized e diversi passaggi 01:08 in 4 pozzetti che sono stati pre-seminato con gamma-irradiati alimentatore strato MEF. Questi piatti possono essere utilizzati per l'analisi di marker pluripotenti da ICC e colorazione AP.</li></ol><p class="jove_title"> 5. Analisi immunocitochimica per la pluripotenza</p><p class="jove_content"> I nostri test ICC è stata condotta su cellule espanse in 4 piatti bene. Tutti i volumi sono elencati nella seguente protocollo deve essere regolata in base alle dimensioni piastra di coltura cellulare.</p><ol><li> Lavare delicatamente le cellule due volte con PBS (senza Mg^{2 +} + O Ca^{2 +}).</li><li> Incubare in 0,5 ml di ghiacciata 0,2% Tween 20 in PBS per bene per 10 minuti.</li><li> Lavare le cellule delicatamente per tre volte con PBS.</li><li> Blocco legame non specifico con 200 microlitri di buffer bloccando per un'ora a temperatura ambiente.</li><li> Incubare le cellule con 200 l di anticorpi specifici primario overnight a 4 ° C (abbiamo usato SSE-1, Nanog e Oct4).</li><li> Lavare delicatamente le cellule due volte con PBS.</li><li> Incubare le cellule con 200 l di anticorpo secondario per 1 ora a temperatura ambiente, mantenendo al riparo dalla luce (abbiamo usato Donkey anti-mouse coniugato rodamina e Donkey anti-coniglio coniugato Rhodamine).</li><li> Lavare delicatamente le cellule due volte con PBS.</li><li> Aggiungi DAPI (concentrazione finale 2 mg / ml in PBS) e incubare 10 minuti per visualizzare nuclei.</li><li> Lavare delicatamente le cellule con PBS</li><li> Aggiungi anti-sbiadimento Aqua-Mount prima immagine utilizzando un microscopio invertito a fluorescenza.</li></ol><p class="jove_title"> 6. Fosfatasi alcalina (AP) colorazione delle colonie cellule iPS</p><ol><li> Colonie iPS dalla sezione 4 possono anche essere analizzati per l'attività di AP utilizzando kit disponibili in commercio e seguendo il protocollo del produttore.</li></ol><p class="jove_title"> Parte 7. Rappresentante Risultati</p><p class="jove_content"> Il Stemgent inducibile DOX Mouse Set TF Lentivirus possono essere usati per riprogrammare le cellule iPS MEF. Dopo la trasduzione del MEF, l'espressione di fattori di trascrizione Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc possono essere rilevati nelle cellule trattate con doxiciclina (DOX +), ma l'espressione poco o niente possono essere rilevati in non trattati (DOX-) cellule (figura 1) . Cambiamenti morfologici progrediranno nel corso del tempo (12 giorni di trattamento DOX in questo esempio) per generare ES più grande, più simile a una cella colonie colonia con bordi definiti e tre crescita dimensionale (figura 2a). DOX quando viene rimosso, si manifesta un ritorno notevole della morfologia cellulare per alcuni cellulari come colonie ES, tuttavia, molte delle colonie hanno mantenuto la loro morfologia iPS (figura 2a). Queste colonie iPS, quando raccolta e diversi passaggi, la visualizzazione tipica espressione pluripotenza marker di fosfatasi alcalina (AP), Nanog, Oct4 e SSE-1 (figura 3). Il tipo di cellule MEF utilizzati in questo esperimento (Nanog-GFP/rtTA cellule MEF) esprimono GFP dal locus endogeno Nanog quando riprogrammato per lo stato di pluripotenza. Espressione GFP può quindi essere usato come un indicatore preliminare per la riprogrammazione di successo (figura 3).</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/1447/1447fig1.jpg" alt="Figure 1" > Figura 1:</strong> Immunocitochimica (ICC) analisi 48 ore dopo il DOX induzione. Il pannello di sinistra (-DOX) è un rappresentante di controllo negativo per l'espressione dei quattro fattori di trasduzione senza induzione DOX. Fattori di trascrizione correttamente espresse sono state confermate dagli anticorpi corrispondenti (indicati in rosso), colorate con DAPI per visualizzare il nucleo.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/1447/1447fig2.jpg" alt="Figure 2" > Figura 2:</strong> Trasformazione morfologica di Nanog-GFP/rtTA MEF allo stato di cellule iPS. A) 100x contrasto di imaging di fase di cellule dimostrare la compattazione e la conversione del MEF in colonie iPS nel corso del tempo dal giorno 3 (D3 + Dox) per il giorno 22 (D22). DOX è stato ritirato il giorno 12. In alto a sinistra del pannello: 20x immagine di controllo negativo da-DOX piatto. B) 200x a contrasto di fase e le immagini di fluorescenza GFP del giorno 18 ha evidenziato post-DOX induzione iPS colonia. C) 200x a contrasto di fase e le immagini di fluorescenza GFP di ulteriori 18 giorni post-DOX induzione iPS colonia.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/1447/1447fig3.jpg" alt="Figure 3" > Figura 3:</strong> Analisi delle colonie iPS. (A) il microscopio a contrasto di fase e colorazione AP di una colonia iPS (200x). (B) Analisi pluripotenza marcatore: pannello di sinistra mostra il contrasto di fase sovrapposizione con l'espressione giornalista GFP riprogrammazione. Espressione GFP riflette il livello di espressione endogena Nanog. Pannello centrale mostra colorazione ICC per i marcatori pluripotenza. Pannello di destra mostra una colorazione DAPI per visualizzare i nuclei (100x).</p>