重新用四个转录因子的小鼠胚胎成纤维细胞诱导多能干细胞的产生，强力霉素诱导慢病毒转导系统

<p class="jove_title"> 1。病毒转导的MEFs</p><ol><li前一天开始你的实验，大衣15厘米的细胞，用0.2％的明胶无菌培养皿中DDH过滤₂ O。过夜孵育盘，在37 ° C和5％的CO₂。</li><li>明胶涂层盘，种子MEF细胞（我们使用Nanog-GFP/rtTA MEF细胞）在4 ×密度液体吸⁵每皿细胞。孵育细胞30毫升MEF生长培养基（450毫升的DMEM与50毫升胎牛血清，5毫升100X非必需氨基酸，5 ml青霉素/链霉素，5毫升200毫米L -谷氨酰胺和0.5毫升55MMβ-巯基乙醇补充）这两天在37 ° C和5％的CO₂直到大约80％汇合。</li><li>吸中期和MEF的增长与集中的慢病毒（4 × 100μL病毒原液+增长29.6毫升培养基）培养基中添加30毫升。轻轻晃动的菜，以确保中期的均匀分布。孵育细胞过夜在37 ° C和5％的CO₂。</li></ol><p class="jove_title"> 2。强力霉素诱导的重编程</p><ol><li> 20-24小时后转导，细胞trypsinize，在5分钟的200 XG离心机和ES / IPS生长介质悬浮（450毫升淘汰赛的DMEM50毫升ES细胞合格的小牛血清，5 ml青霉素/链霉素补充， 5毫升200毫米L -谷氨酰胺，0.5毫升β-巯基乙醇和25μLLIF）。种子转导的细胞培养皿大小适当集中MEF的（我们用2.5 × 10<sup> 5</sup每10厘米的盘，重新编程的效率实验和殖民地隔离和2>细胞<sup> 4</sup国际刑事法院的实验在4孔板，每孔细胞）。在37> 2</sub>。注：任何剩余的细胞可以液态氮冷冻，供日后分析。</li><li>吸液和替换ES / IPS中等准备补充新鲜和强力霉素的终浓度为2微克/毫升（我们还添加了没有DOX的培养基作为阴性对照）。孵育37 ° C和5％的CO₂。</li></ol><p class="jove_title"> 3。免疫组织化学分析转染效率</p><p class="jove_content"> 48小时后，强力霉素诱导，确定采用免疫组织化学（ICC）的转导效率。 4孔板replated的细胞上，开展国际刑事法院的测试。根据细胞培养板的大小，应调整以下协议中列出的所有卷。</p><ol><li>轻轻的细胞用PBS清洗一次（无镁<sup> 2 +</sup+或Ca^{2 +}）。</li><li>修复细胞，用500μL0.5毫升4％多聚甲醛的PBS在室温下15分钟。</li><li>洗细胞轻轻两次用PBS。</li><li>通透细胞，加入500μL冰冷的0.2％吐温® -20的PBS。孵育10分钟，在室温。</li><li>洗细胞轻轻两次用PBS。</li><li>座200μL阻断缓冲液在室温下1小时的非特异性结合。</li><li> 200μL的特定抗体的细胞在4℃过夜孵育° C（我们用Oct4的，SOX2，KLF4和c – Myc）。</li><li>洗细胞轻轻两次用PBS。</li><li> 200μL二次抗体培养的细胞在室温下1小时，保护光板（我们用驴抗兔若丹明共轭，驴抗山羊AlexaFluor ® 594驴抗小鼠若丹明共轭轭，和驴抗兔若丹明共轭）。</li><li>洗细胞轻轻两次用PBS。</li><li>添加的DAPI（终浓度为2微克/毫升的PBS），孵育10分钟可视化核。</li><li>轻轻地用PBS清洗细胞。</li><li>前加入防褪色AQUA式成像使用倒置荧光显微镜。</li></ol><p class="jove_title"> 4。 IPS细胞集落的分离和扩大</p><ol><li（第2条所述）>重编程过程启动后，监测的文化和取代中期每48小时。我们的第一个12天的使用强力霉素培养基培养细胞，并随后从中期的强力霉素，以确保该IPS殖民地手动扩张回升将DOX的独立。</li><li>细胞应每天监测为重编程过程的指标的形态学变化;或使用Nanog-GFP/rtTA MEF细胞，监察形态和GFP荧光，以确定重新编程的殖民地。每个实验会有所不同，但殖民地足够大，一般为16至22天的隔离。在这段时间内确定的殖民地，然后可以手动分离和胰酶消化扩张和分析。</li><li>隔离和trypsinizing重新编程殖民地之前的一天，准备与γ-辐照饲养层MEFs播种密度5 × 10的24孔板⁴每口井的细胞。在37 ° C和5％的二氧化碳孵育过夜₂。</li><li>手动挑选每个IPS的殖民地和trypsinize游离细胞聚集。重制版的ES / IPS与γ射线辐照饲养层MEFs前接种在24孔板单井中等iPS细胞。井应接种密度为2 × 10⁵细胞/孔。孵育37 ° C和5％的CO₂。每24小时更换媒体。</li><li>每天增长和绿色荧光显示器的iPS殖民地。我们孵育前6天传代我们的文化。</li><li>确定的24孔板的孔均匀表达GFP。具有良好的GFP表达式的水井可胰酶消化和已经与伽马射线辐照接驳层MEFs前播种为4好盘子传1:8。 ICC和AP染色，这些板块可以用于多能干标记分析。</li></ol><p class="jove_title"> 5。为多能性的免疫组织化学分析</p><p class="jove_content"我们的国际刑事法院的测试进行了4孔板扩大细胞。根据细胞培养板的大小，应调整以下协议中列出的所有卷。</p><ol><li>轻轻地用PBS清洗细胞两次（无镁<sup> 2 +</sup+或Ca^{2 +}）。</li><li在冰冷的0.2％吐温20的PBS，每孔10分钟0.5毫升孵育。</li><li>清洗细胞，用PBS轻轻三次。</li><li>座200μL阻断缓冲液在室温下1小时的非特异性结合。</li><li> 200μL的特定抗体的细胞在4℃过夜孵育° C（使用SSEA – 1，Nanog和Oct4的）。</li><li>洗细胞轻轻两次用PBS。</li><li> 200μL二次抗体培养的细胞在室温下1小时，保持光（我们用驴抗小鼠若丹明共轭和驴抗兔若丹明共轭）。</li><li>洗细胞轻轻两次用PBS。</li><li>添加的DAPI（终浓度为2微克/毫升的PBS），孵育10分钟可视化核。</li><li>轻轻地用PBS清洗细胞</li><li>前加入防褪色AQUA式成像使用倒置荧光显微镜。</li></ol><p class="jove_title"> 6。碱性磷酸酶（AP）染色的iPS细胞集落</p><ol><li> IPS从第4殖民地，也可以分析美联社活动利用市售试剂盒，并按照制造商的协议。</li></ol><p class="jove_title">第7部分。代表性的成果</p><p class="jove_content"> Stemgent阿霉素诱导小鼠TF慢病毒设置可用于iPS细胞重新编程MEFs。转导的MEFs，转录因素Oct4的表达后，SOX2的，KLF4和c – Myc基因可以被用强力霉素治疗的细胞中检测到（阿霉素+），但很少或根本没有表达可以被检测到未经处理的（DOX -）细胞（图1） 。随着时间的推移，在这个例子中的阿霉素治疗（12天），以产生更大，更ES定义的菌落边缘和三维增长（图2a）细胞样菌落形态变化会进步。当DOX被删除，有一个明显的细胞形态回归的一些胚胎干细胞样的殖民地，但是，许多殖民地保持他们的IPS形态（图2a）。这些IPS菌落，挑传代时，显示碱性磷酸酶（AP），Nanog的Oct4和SSEA – 1（图3）典型的多能性标志物表达。 MEF细胞的重新编程，以全能性状态时，从内源性Nanog的轨迹，在这个实验中（Nanog-GFP/rtTA MEF细胞）表达绿色荧光蛋白的类型。 GFP的表达，因此可以被用来作为一个成功的重新编程（图3）的初步指标。</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/1447/1447fig1.jpg" alt="Figure 1" >图1：</strong>免疫细胞化学（ICC）的分析，48小时后阿霉素诱导。最左边的面板（DOX）的是有代表性的四个传导因子的表达没有阿霉素诱导的阴性对照。正确表达的转录因子被证实DAPI染色，以可视化的细胞核，由相应的抗体（红色显示）。</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/1447/1447fig2.jpg" alt="Figure 2" >图2：</strong> Nanog-GFP/rtTA MEFs iPS细胞状态的形态转换。一）100X阶段展示压实和MEFs转换成的iPS殖民地的时间从3天（D3 + DOX）第22天（D22）的细胞的相衬成像。 DOX的是12天撤回。左上面板：20倍阴性对照的图像从DOX的板块。二）200X相衬和GFP荧光图像突出一天18后的阿霉素诱导的iPS殖民地。三）200X相衬和GFP荧光图像，增加一天18后的阿霉素诱导的iPS殖民地。</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/1447/1447fig3.jpg" alt="Figure 3" >图3：</strong>分析的iPS殖民地。 （一）相差显微镜和AP染色的IPS殖民地（200X）。 （二）多能性标志物分析：左侧面板显示阶段与绿色荧光蛋白重新编程记者表达的对比覆盖。 GFP的表达，反映内源性的Nanog的表达水平。中间面板显示国际刑事法院的多能性标志物的染色。右侧的面板显示DAPI染色，以形象化的原子核（100X）。</p>