Отслеживание динамики мышц приживления у мелких животных по В Vivo Флуоресцентные изображения
Summary
Мы описываем<em> В естественных условиях</em> Флуоресценции протокол для контроля мышц регенерации GFP-меченых миобластов после трансплантации в скелетных мышцах как здоровых, так и дистрофических мышей. Этот протокол может быть адаптирован для изучения регенерации мышц трансплантацией других видов клеток и в других мышечных условиях.
Abstract
Мышечные дистрофии в группу дегенеративных заболеваний мышц характеризуется прогрессирующей потерей сократительной мышечных клеток. В настоящее время, нет никаких лечебных лечения. Последние достижения в области биологии стволовых клеток породили новые надежды на развитие эффективных ячейке на основе терапии для лечения этих заболеваний. Трансплантация различных типов стволовых клеток, меченных флуоресцентных белков в мышцах дистрофических моделей на животных было широко используется в полевых условиях. Неинвазивный метод с возможностью отслеживать судьбу трансплантированных ячейки продольно может еще больше наша способность оценивать мышц приживления на пересаженные клетки более точно и эффективно.
В настоящем исследовании мы демонстрируем, что в естественных условиях флуоресценции является чувствительным и надежным методом для отслеживания пересаженных GFP (зеленый флуоресцентный белок)-меченых клеток у мышей скелетных мышц. Несмотря на озабоченность по поводу фон, связанный с использованием внешнего света необходимо для возбуждения флуоресцентного белка, мы обнаружили, что с помощью либо обнаженной мыши или устранение волос с реагентами удаления волос много эта проблема устранена. Использование ПЗС-камеры, флуоресцентный сигнал может быть обнаружен в передней большеберцовой (ТА) мышцы после инъекции 5 х 10 5 клеток с обеих GFP трансгенных мышей или EGFP трансдуцированных миобластов культуры. Для более поверхностные мышцы, такие как Лонга разгибателей пальцев (ДЭС), инъекции меньшее число клеток производит обнаруженный сигнал. Интенсивность сигнала может быть измерена и количественно, как число излученных фотонов в секунду в области интереса (ROI). Поскольку полученные изображения показывают четкие границы демаркации привиты области, размер возврата инвестиций могут быть измерены, а также. Если ноги расположены последовательно каждый раз, изменения в полное число фотонов в секунду на мышцы и размер рентабельности отражают изменения в количестве привитых клеток и размер привиты области. Поэтому изменения в той же мышцы в течение долгого времени, исчисляемым. В естественных условиях флуоресцентного метод визуализации была использована в основном для отслеживания роста опухолеиндуцирующего клетки, наше исследование показывает, что это мощный инструмент, который позволяет нам отслеживать судьбу трансплантированных стволовых клеток.
Protocol
Discussion
Мы создали надежную и стабильную платформу визуализации для отслеживания флуоресценции меченых трансплантированных клеток в принимающих скелетных мышц в этом исследовании. GFP-меченых миобластов из GFP трансгенные мыши обозначает тип стволовых клеток, которые будут кандидатами в клеточной терапии в будущем. Постоянной манипуляции, включая сотовые номера, инъекции клеток, ясный фон, изображение положение и машина параметр имеет важное значение для получения высокого качества изображения и, особенно, для количественного анализа.
Флуоресценции имеет множество применений в области биомедицинских исследований, как это неинвазивный, простой в использовании и имеет высокую пропускную способность. Кроме того флуоресценции может обеспечить количественное измерение основано на фотоотсчетов, хотя из-за рассеяния, ослабления и поглощения, свет не может проникнуть на большое расстояние в ткани, что является недостатком метода. Усилия продолжаются уже использовать красный или ближней инфракрасной репортер увеличить глубину проникновения света.
Еще одно преимущество флуоресценции является то, что переводимые в клиники, если конкретные флуоресцентные репортер, предназначен для использования человеком. По сравнению с МРТ, КТ и ПЭТ, флуоресценции обладает высокой гибкостью, поскольку она не требует дорогостоящего оборудования и визуализации агентов. Одним из примеров является флуоресценция основе эндоскопа и микро-эндоскоп, которые были использованы в клинике. Объединив флуоресценции с другими методами, мы ожидаем достичь возможности получения как анатомические и функциональные информацию о лежащей в основе биологических процессов.
Acknowledgements
Работа Z и Y Ян Ван стало возможным благодаря гранту от K02 AR051181 NIAMS / NIH, гранты от мышечной дистрофии ассоциации и Гарвардского института стволовых клеток для Y Ван. Работа Q Цзэн и X Сюй поддерживает программу грантов присуждено Оптический Лаборатории изображений из Brigham и женской больницы. Авторы хотели бы поблагодарить Вэнь Лю из Департамента анестезии, BWH, за техническую помощь в ячейке работы.
Materials
| Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| NightOwl LB981 | Berthold Technologies |
Referenzen
- Ballou, B., Ernst, L. A., Waggoner, A. S. Fluorescence imaging of tumors in vivo. Curr Med Chem. 12, 795-805 (2005).
- Green, . fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
- Godavarty, A., Sevick-Muraca, E. M., Eppstein, M. J. Three-dimensional fluorescence lifetime tomography. Med Phys. 32, 992-1000 (2005).
- Graves, E. E., Weissleder, R., Ntziachristos, V. Fluorescence molecular imaging of small animal tumor models. Curr Mol Med. 4, 419-430 (2004).
- Graves, E. E., Yessayan, D., Turner, G., Weissleder, R., Ntziachristos, V. Validation of in vivo fluorochrome concentrations measured using fluorescence molecular tomography. J Biomed Opt. 10, 44019-44 (2005).
- Gurfinkel, M., Ke, S., Wen, X., Li, C., Sevick-Muraca, E. M. Near-infrared fluorescence optical imaging and tomography. Dis Markers. , 107-121 .
- Lee, J., Sevick-Muraca, E. M. Three-dimensional fluorescence enhanced optical tomography using referenced frequency-domain photon migration measurements at emission and excitation wavelengths. J Opt Soc Am A Opt Image Sci Vis. 19, 759-771 (2002).
- Xu, X., Yang, Z., Liu, Q., Wang, Y. In vivo fluorescence imaging of muscle regeneration by transplanted eGFP-labeled myoblasts. , (1985).
- Hoffman, R. M. In vivo cell biology of cancer cells visualized with fluorescent proteins. Curr Top Dev Biol. 70, 121-144 (2005).
- Coulton, G. R., Morgan, J. E., Partridge, T. A., Sloper, J. C. The mdx mouse skeletal muscle myopathy: I. A histological, morphometric and biochemical investigation. Neuropathol Appl Neurobiol. 14, 53-70 (1988).
- Morgan, J. E., Partridge, T. A. Muscle satellite cells. Int J Biochem Cell Biol. 35, 1151-116 (2003).
- Mendell, J. R., Kissel, J. T., Amato, A. A., King, W., Signore, L., Prior, T. W., Sahenk, Z., Benson, S., McAndrew, P. E., Rice, R. Myoblast transfer in the treatment of Duchenne’s muscular dystrophy. N Engl J Med. 333, 832-838 (1995).
- Bogdanovich, S., Perkins, K. J., Krag, T. O., Khurana, T. S. Therapeutics for Duchenne muscular dystrophy: current approaches and future directions. J Mol Med. 82, 102-115 (2004).
- Morgan, J. E., Coulton, G. R., Partridge, T. A. Mdx muscle grafts retain the mdx phenotype in normal hosts. Muscle Nerve. 12, 401-409 (1989).
- Sherwood, R. I., Christensen, J. L., Weissman, I. L., Wagers, A. J. Determinants of skeletal muscle contributions from circulating cells, bone marrow cells, and hematopoietic stem cells. Stem Cells. 22, 1292-1304 (2004).
- Cerletti, M., Jurga, S., Witczak, C. A., Hirshman, M. F., Shadrach, J. L., Goodyear, L. J., Wagers, A. J. Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles. Cell. 134, 37-47 (2008).
