작은 동물의 근육 Engraftment의 역학에 의해 추적 VIVO에서 형광 이미징

셀 준비 위성 세포 분리 마취에서 GFP 형질 전환 마우스 (C57BL / 카 – βactin – EGFP)의 사지 근육이 제거됩니다. 작은 조각으로 절단 후, 위성 세포 37 1 시간 동안 2 % dispase의 collagenase 솔루션 다진 조직을 잠복기 ° C.를하여 효소 dissociated 아르 햄 F – 10 20 % FBS를 포함하는 성장 매체와 효소 소화를 중화, 파스퇴르 피펫과 반복 triturating하여 근육을 떼어 놓다. 세포는 세포 스트레이너 (ø70 – 100μm)를 통해 필터링 후 37에서 1 시간 동안 비 코팅 접시 ° C.에 비쳐지게 만들려합니다 부드럽게 콜라겐 코팅 접시에 뜨는와 플레이트를 제거합니다. myoblasts 정화 나중에이 단계 1 시간 반복합니다. (미리 판) 시간에 미디어 및 플레이트 세포를 변경합니다. 최종 정화 myoblasts는 매체 햄 F – 10, 20 % FBS, 100 U / ML 페니실린, 37 ° C 5 % CO2와 95 %의 공기를 100 μg / ML 스트렙토 마이신 (의 성장 매체)이있는에 양식 있습니다. 문화 10 NG / ML의 기본 FGF의 추가와 함께 성장 매체의 기본 myoblasts을 확장합니다. 생체내 실험의 모든을 위해, 우리는 TA의 근육 당 5×10 5 세포를 주입. myoblasts을 수확하면, 우리는 0.25 % 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 사용하여 세포를 분리하여 두 번 PBS로 그들을 씻으십시오. 휴대폰 번호는 hemocytometer로 집계되고 세포는 5×10 4 셀 / μl의 농도에 HBSS에 resuspended 있습니다. HBSS에 집중 세포는 얼음에 게재 및 수집 후 1 시간 이내에 주입하고 있습니다. VIVO 이미징에 4~6주의 나이에 남자 MDX 마우스는 잭슨 실험실에서 구입 동물 주거 시설에서 유지 관리됩니다. 환경에 숙박 시설 중 하나에 대한 주 후 생쥐는 교양 세포와 이식 준비하고 있습니다. 세포 이식하기 전에 마우스 케타민을 (100 MG / kg)과 Xylazine (10 MG / kg)의 혼합물의 intraperitoneal (IP) 주입에 의해 anesthetized 있습니다. 다음 TA 근육 주변 머리가 다리에 나이르를 적용하고 증류수로 깨끗이 닦아 30 초 동안 대기에 의해 제거됩니다. 마우스가 마취하에 여전히 있지만, 10μl HBSS에 5×10 5 전지 천천히 30 게이지 바늘을 사용하여 3 점 각 TA 근육에 주입하고 있습니다. 4 단계 후, 마우스는 정기적으로 생체내 형광 이미징에 의해 몇 군데하실 수 있습니다. 높은 민감한 전하 결합 카메라가 장착된 형광 이미징 역 NightOwl LB981 (베르톨드 기술 주식 회사)는, 생쥐의 방해 다리의 이미지를 얻는 데 사용됩니다. 생체내 이미징에의 날, 우리는 먼저 TA 근육에 머리 regrowth를 확인하십시오. 필요한 경우, 우리는 케타민을과 Xylazine의 혼합으로 마우스를 anesthetizing 후, 위에 설명된대로 머리를 제거하는 나이르를 다시 적용됩니다. 마우스가 마취하는 동안, 우리는 검은 비 형광 종이 (스트라 스에서 검은 Artagain 용지)의 작품에 자주 발생하는 위치에 마우스를 놓으십시오. 충분히 더 나은 이미지를위한 TA 근육을 노출하기 위해, 우리는 종이로 뒷다리 발톱 테이프. 우리는 이미징 챔버와 위치 카메라의 시야의 중심에 몇 군데로 뒷다리 다리에 마우스를 놓으십시오. 우리는 처음 5 초 노출 시간과 다리의 전통 회색 스케일 사진 사진을 찍을 수있는 방사 필터를 전환합니다. 필요한 경우 카메라의 마우스와 초점의 위치를​​ 재조정. 노출 시간 (1250 MS), 표본의 높이 (0.9 ㎝) 등 이미징 매개 변수는 실험 과정에서 지속적으로 보관됩니다. 그러면 녹색 형광 단백질 파장에 해당하는 방출 필터에 스위치. 우리는 1250 MS와 1 비닝 번호 노출 시간 형광 이미지를 가져가라. 이미징 후, 마우스 회복을 기다릴 수있는 케이지에 이미징 챔버에서 제거됩니다. 분석을 위해, 우리는 초당 광자의 관점에서 그들의 강도를 측정하는 형광 신호를 통해 관심 영역 (ROI)을 그립니다. 우리는 또한 다른 부량 값으로 픽셀의 측면에서 투자 수익 (ROI)의 크기를 측정합니다. 세로 데이터를 취득하기 위해 필요한 경우 이미징 실험은 몇 개월 동안 더 자주 매주 반복하거나 수 있습니다. 실험의 마지막에는, 마우스 euthanized되고 TA 근육은 조직학 분석에 수확합니다.