Tracking Dynamica van Muscle innesteling in kleine dieren door In Vivo TL-Imaging
Summary
Beschrijven we een<em> In vivo</em> Fluorescentie beeldvorming protocol om regeneratie van de spieren te controleren door GFP-gelabelde myoblasten na de transplantatie in de skeletspieren bij zowel gezonde en dystrofische muizen. Dit protocol kan worden aangepast aan de regeneratie van de spieren studie van transplantatie van andere typen cellen en in andere gespierd omstandigheden ook.
Abstract
Spierdystrofieën zijn een groep van degeneratieve spierziekten gekenmerkt door een progressief verlies van contractiele spiercellen. Op dit moment is er geen genezende behandeling beschikbaar is. Recente ontwikkelingen in stamcelbiologie hebben nieuwe hoop voor de ontwikkeling van effectieve cell-based therapieën voor deze ziekten te behandelen. Transplantatie van verschillende soorten stamcellen gelabeld met fluorescerende eiwitten in de spieren van dystrofische diermodellen is in grote lijnen in het veld gebruikt. Een niet-invasieve techniek met de mogelijkheid om het getransplanteerde lot van de cel spoor lengterichting verder kunnen ons vermogen om de spieren innesteling te evalueren door getransplanteerde cellen meer nauwkeurig en efficiënt.
In de huidige studie hebben we laten zien dat in vivo fluorescentie beeldvorming is een gevoelige en betrouwbare methode voor het bijhouden van getransplanteerde GFP (Green Fluorescent Protein)-gelabelde cellen in de muis skeletspieren. Ondanks de bezorgdheid over de achtergrond te wijten aan het gebruik van een extern licht nodig voor excitatie van fluorescerend eiwit, vonden we dat met behulp van hetzij naakt muis of het elimineren van haar met ontharing reagentia veel van dit probleem wordt geëlimineerd. Met behulp van een CCD camera, kan het fluorescerende signaal worden gedetecteerd in de tibialis anterior (TA) spier na injectie van 5 x 10 5 cellen van zowel GFP transgene muizen of eGFP getransduceerde myoblast cultuur. Voor meer oppervlakkige spieren, zoals de extensor digitorum longus (EDL), injectie van minder cellen produceert een detecteerbaar signaal. Intensiteit van het signaal kan worden gemeten en gekwantificeerd als het aantal uitgezonden fotonen per seconde in een regio van belang (ROI). Omdat de verkregen beelden tonen duidelijke grenzen afbakenen van het gebied geënt, kan de grootte van de ROI ook worden gemeten. Als de benen worden steeds geplaatst elke keer, de veranderingen in het totale aantal fotonen per seconde per spier en de grootte van de ROI weerspiegelen de veranderingen in het aantal geënt cellen en de grootte van het geënte gebied. Daarom zijn de veranderingen in dezelfde spier na verloop van tijd zijn kwantificeerbaar. In vivo fluorescentie beeldvormende techniek is voornamelijk gebruikt om de groei van cellen tumorogenic spoor, onze studie toont aan dat het een krachtig instrument dat ons in staat stelt om bij te houden over het lot van de getransplanteerde stamcellen.
Protocol
Discussion
We zetten een betrouwbare en stabiele imaging platform voor het bijhouden van de fluorescentie gelabelde getransplanteerde cellen in het gastland skeletspieren in deze studie. GFP-gelabelde myoblasten van GFP transgene muis staat voor een soort van volwassen stamcellen die zullen worden kandidaten voor celtherapie in de toekomst. Een constante manipulatie zoals mobiele nummer, cel-injectie, heldere achtergrond, imaging positie en de machine parameter is van belang voor het verkrijgen van een hoge kwaliteit beeld en in het bijzonder voor de kwantitatieve analyse.
Fluorescentie beeldvorming heeft veel toepassingen in biomedisch onderzoek zoals het is non-invasief, eenvoudig te gebruiken, en heeft een hoge throughput. Daarnaast fluorescentie beeldvorming kan een kwantitatieve meting op basis van de foton telt, hoewel te wijten aan de verstrooiing, demping en absorptie, kan het licht niet door een grote afstand in het weefsel, dat is een tekortkoming van de techniek. Er zijn inspanningen gedaan om rood of nabij-infrarood reporter te gebruiken om de indringdiepte van het licht te verhogen.
Een ander voordeel van fluorescentie beeldvorming is dat het vertaalbaar naar klinieken als de specifieke tl-reporter is goedgekeurd voor menselijk gebruik. In vergelijking met MRI, CT en PET, fluorescentie beeldvorming heeft een hoge flexibiliteit als het niet nodig dure hardware en imaging agenten. Een voorbeeld hiervan is het fluorescentie-based endoscoop en micro-endoscoop die zijn gebruikt in klinieken. Door het combineren van fluorescentie beeldvorming met andere modaliteiten, verwachten we de mogelijkheid om zowel de anatomische en functionele informatie over de onderliggende biologische processen te verwerven bereiken.
Acknowledgements
Het werk van Z en Y Yang Wang werd mede mogelijk gemaakt door subsidie van K02 AR051181 NIAMS / NIH, subsidies aan spierdystrofie Vereniging en Harvard Stem Cell Institute for Y Wang. Het werk van Q en X Zeng Xu worden ondersteund door een programma subsidie toegekend aan de Optical Imaging Lab van het Brigham and Women's Hospital. De auteurs willen graag Wen Liu bedanken van de afdeling Anesthesie, BWH, voor technische hulp in cel te werken.
Materials
| Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| NightOwl LB981 | Berthold Technologies |
Referenzen
- Ballou, B., Ernst, L. A., Waggoner, A. S. Fluorescence imaging of tumors in vivo. Curr Med Chem. 12, 795-805 (2005).
- Green, . fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
- Godavarty, A., Sevick-Muraca, E. M., Eppstein, M. J. Three-dimensional fluorescence lifetime tomography. Med Phys. 32, 992-1000 (2005).
- Graves, E. E., Weissleder, R., Ntziachristos, V. Fluorescence molecular imaging of small animal tumor models. Curr Mol Med. 4, 419-430 (2004).
- Graves, E. E., Yessayan, D., Turner, G., Weissleder, R., Ntziachristos, V. Validation of in vivo fluorochrome concentrations measured using fluorescence molecular tomography. J Biomed Opt. 10, 44019-44 (2005).
- Gurfinkel, M., Ke, S., Wen, X., Li, C., Sevick-Muraca, E. M. Near-infrared fluorescence optical imaging and tomography. Dis Markers. , 107-121 .
- Lee, J., Sevick-Muraca, E. M. Three-dimensional fluorescence enhanced optical tomography using referenced frequency-domain photon migration measurements at emission and excitation wavelengths. J Opt Soc Am A Opt Image Sci Vis. 19, 759-771 (2002).
- Xu, X., Yang, Z., Liu, Q., Wang, Y. In vivo fluorescence imaging of muscle regeneration by transplanted eGFP-labeled myoblasts. , (1985).
- Hoffman, R. M. In vivo cell biology of cancer cells visualized with fluorescent proteins. Curr Top Dev Biol. 70, 121-144 (2005).
- Coulton, G. R., Morgan, J. E., Partridge, T. A., Sloper, J. C. The mdx mouse skeletal muscle myopathy: I. A histological, morphometric and biochemical investigation. Neuropathol Appl Neurobiol. 14, 53-70 (1988).
- Morgan, J. E., Partridge, T. A. Muscle satellite cells. Int J Biochem Cell Biol. 35, 1151-116 (2003).
- Mendell, J. R., Kissel, J. T., Amato, A. A., King, W., Signore, L., Prior, T. W., Sahenk, Z., Benson, S., McAndrew, P. E., Rice, R. Myoblast transfer in the treatment of Duchenne’s muscular dystrophy. N Engl J Med. 333, 832-838 (1995).
- Bogdanovich, S., Perkins, K. J., Krag, T. O., Khurana, T. S. Therapeutics for Duchenne muscular dystrophy: current approaches and future directions. J Mol Med. 82, 102-115 (2004).
- Morgan, J. E., Coulton, G. R., Partridge, T. A. Mdx muscle grafts retain the mdx phenotype in normal hosts. Muscle Nerve. 12, 401-409 (1989).
- Sherwood, R. I., Christensen, J. L., Weissman, I. L., Wagers, A. J. Determinants of skeletal muscle contributions from circulating cells, bone marrow cells, and hematopoietic stem cells. Stem Cells. 22, 1292-1304 (2004).
- Cerletti, M., Jurga, S., Witczak, C. A., Hirshman, M. F., Shadrach, J. L., Goodyear, L. J., Wagers, A. J. Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles. Cell. 134, 37-47 (2008).
