ב electroporation ברחם לשעבר vivo על ביטוי גנים בתאים עכבר גנגליון רשתית

חלק 1: הגדרת עבור ברחם לשעבר electroporations vivo רשתית 1. עבור שני ברחם לשעבר electroporations vivo רשתית השתמש חולץ אלקטרודה להכין קנס שקצהו micropipettes ולשבור את קצה (או שפוע קצה) כדי להפוך את נקודת זווית. הכן את פתרונות ה-DNA לריכוזים הרצוי ולהוסיף כמות קטנה של גרין דיי מהיר (0.05%) כדי להמחיש זריקות. אני ממליץ על פתרון ה-DNA 5 μl לכל אמא שכן electroporations ברחם הרשתית 1 פתרון ה-DNA μl לנפש עובריים עבור vivo לשעבר electroporations הרשתית. כלול ביטוי של GFP לבנות (או חלבון פלואורסצנטי אחרות) כדי להמחיש נוירונים transfected. לעקר מכשירי ניתוח דרך החיטוי. מכינים את תערובת קטמין-xylazine הרדמה עם יחס הבא (שהופך ~ 0.2 מ"ל עבור כל הנשי בהריון): יחס 1.0:0.2:4.6 נפח של 100 מיקרוגרם / קטמין מ"ל: 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​xylazine: מלוחים. הרדמה אחרים ניתן להשתמש. 2. שכן electroporations ברחם רשתית בלבד הפעל את כרית החימום לכסות את זה עם כרית חיתול. הכן את הפתרון לאנטיביוטיקה antimycotic (1:100) במאגר מלוחים פוספט (PBS) וחם על כרית חימום. הכן ~ 2 מ"ל עבור כל סכר. מקום סטרילי, מסוננים PBS באמבט מים חמים. 3. עבור vivo לשעבר electroporations רשתית בלבד הכן מחומצן בינוני חופשי בסרום (SFM) עבור הדגירה הרשתית: הבועה 25 מ"ל של DMEM/F12 עם 95% חמצן / פחמן דו חמצני 5% ≥ 2 שעות. עד בינוני 25 מ"ל חמצן, להוסיף 0.25 גר 'שור בסרום אלבומין (BSA), תוספת 250 μl שלה 50 μl פתרון פניצילין, סטרפטומיצין. מערבבים את הפתרון לפרק את ארגון ה-BSA, ואז לסנן סטרילי הפתרון. פתרון זה צריך להיעשות טריים עבור כל ניסוי electroporation. הכן בינוני SFM methylcellulose + 0.4% עבור הדגירה explant רשתית: החיטוי 0.20 גרם של methylcellulose בבקבוק 150 מ"ל עם מגנט ומערבבים. הכן 50 מ"ל של SFM (כאמור לעיל, ללא מבעבע) ולהוסיף בקבוק methylcellulose autoclaved. מערבבים את הפתרון הזה ב 4 ° C למשך הלילה. סינון סטרילי פתרון זה היום בחנות הבאים ב 4 ° C, פתרון זה יכולים להישמר למשך חודש 1 ~. ביום קציר explant הרשתית (חלק 5), להכין מנות עבור ציפוי explant הרשתית: Coat בתחתית צלחות זכוכית תרבות עם 250 μl של פולי-L-ornithine עבור ≥ 2 שעות 37 ° C. (לחלופין, מאכלים יכולים להיות מצופים poly-L-ornithine ביום הקודם מודגרות לילה ב 4 מעלות צלסיוס) המנות לשטוף מספר פעמים עם PBS, אז מנות מעיל עם μl של 200 מיקרוגרם 10 / ml laminin ב DMEM/F12 עבור ≥ 2 שעות ב 37 ° C. לשטוף כלים כמה פעמים עם PBS על 37 ° C ולהשאיר על PBS עד explants מוכנים ציפוי. עבור מבחני הגבול, מנות מעיל עם פולי-ornithine לעיל, ואחר כך חצי מעיל של המנה עם חלבון של עניין יחד עם סמן פלואורסצנטי לדמיין את הגבול (כגון Alexa פלואוריד 555 מצומדות כדי BSA, 1:800) עבור 2 שעות 37 ° C. לשטוף עם PBS, ולאחר מכן להוסיף laminin כמתואר לעיל. 2A חלק: ב electroporation ברחם הרשתית ואת electroporating הזרקת DNA לתוך רשתיות E14.5 Murine in vivo הזרק 0.15 מ"ל של intraperitoneal תמהיל הרדמה (IP) לתוך סכר E13.5-E14.5 הבמה. זה אמור לקחת 3-7 דקות עד שאמא הגיעה במטוס כירורגית של הרדמה. עכבר בהרדמה מלאה לא צריך להגיב צביטה של ​​hindpaw. במהלך תקופה זו, לחתוך חתיכה קטנה של parafilm ו pipet ~ 5 ul של פתרון ה-DNA על parafilm. בנד הבוכנה (חוט מתכת) בזווית של ° 90 מעלות להכניס אותו לתוך micropippette נעצרה. שימוש הבוכנה, לשאוב את הפתרון דנ"א לתוך micropipette (באמצעות מיקרוסקופ לנתח יכול לסייע בתהליך זה). לאחר שהאם הגיעה במטוס כירורגית של הרדמה, להשתמש במכונת גילוח חשמלית לגלח ~ 2 אינץ באזור של הבטן של אמא, אז מקום בצד הגבי שלה על כרית חימום. Prep האזור מגולח על ידי מנגב עם כרית אלכוהול ואחריו כרית יוד מינימום של שתי פעמים. מניחים ירידה של משחה Vet עיניים על כל עין כדי למנוע כיב בקרנית העיניים בזמן שהאם נמצאת תחת הרדמה כללית. בעזרת מלקחיים, אחוז העור להשתמש במספריים לעשות חתך אנכי לאורך קו האמצע (~ 1 ס"מ ארוך) דרך העור של שרירי הבטן, לחשוף את הצפק. הרם את הצפק עם מלקחיים ולעשות חתך אנכי דומה דרך הממברנה הזאת כדי לחשוף את חלל הבטן (איור 1). לאחר מכן לעטוף את שדה הניתוח עם פדי גזה כדי למנוע את תוכן הבטן ליצור קשר ולהיות מזוהמים בשיערשל החיה. משוך לאחור את העור הצפק עם מלקחיים ולהשתמש מרית לנתח כדי לחלץ את העובר דרך החתך (לבחור את העובר הנגיש ביותר). מניחים את מרית בין 2 העוברים ומשוך בעדינות את שרשרת עובריים מתוך חלל הבטן. אתה יכול למשוך החוצה את שרשרת עובריים עם האצבעות. * מכאן ואילך, לשמור על העוברים hydrated עם PBS סטרילי * שמור על אמא על כרית חימום, מקומה תחת מיקרוסקופ הניתוח, עיסוי עובר כך הרשתית היא פונה כלפי מעלה. אני ממליץ להתחיל עם העובר או המדיאלי ביותר או לרוחב, מה שהופך אותו קל יותר לעקוב אחר שבו היו עוברים electroporated. קח את micropipette ביד הדומיננטית שלך לייצב את העובר עם היד השנייה. עם micropipette, לנקב את הרשתית דרך דופן הרחם שק השפיר. בהתאם חדות של micropipette, זה עלול לקחת כמות נכבדה של לחץ לחדור את דופן הרחם, אבל פעם אחת דרך, micropipette יכנס את העובר ואת אידיאלי הרשתית. זה יכול להיות קשה לשלוט לאמוד את עומק micropipette כפי שהוא מזין את העובר. יקטין את כמות התנועה micropipette פעם זה ניקבו את קרום כדי למנוע להגדיל את החור בכניסה, וכתוצאה מכך דליפה של מי שפיר העובר ומוות. הימנע פירסינג כלי דם בתוך דופן הרחם, כמו זה יגרום לדימום למוות בעובר. ברגע שאתם בטוחים כי micropipette חתמה את הרשתית, אתה מוכן לגרש את פתרון ה-DNA לתוך הרשתית. לאט לאט לוחץ על המתג בו זמנית למשוך את micropipette, להבטיח כי ה-DNA מוזרק לאורך הנתיב של micropipette, כפי micropipette לעתים קרובות חודר עמוק אל הרשתית. אם אתה ברשתית, לגרש 0.5 μl (ניתן למדידה על ידי 1 השנתות μl על micropipette) לחלל extraretinal בין השכבה החיצונית של הרשתית לבין אפיתל הפיגמנט ברשתית (הרשתית). אתה צריך לראות צבע ירוק ממלא את הרשתית ואת דולף לתוך מי השפיר (איור 1). משוטים electroporation צריך להישמר בצלחת פטרי PBS מלא במהלך הניתוח. בעדינות במקום משוטים בצידי הראש עובר עם ההנעה (+) חיובי באותו צד כמו העין מוזרק. למרוח כמות מתונה של לחץ כדי לייצב את הראש, אבל לא ללחוץ חזק מדי, כמו זה יצוץ את שק מי השפיר ואת התוצאה במוות העובר. כאשר האלקטרודות נמצאים במקום, לספק 5 40-V, 50 ms פולסים מרובע בתדר של 60 הרץ. אין זה יוצא דופן לאם להתעוות עקב בריחה הנוכחי על העור והשרירים. חזור על שלבים 7-9 עבור כל העובר להיות מוזרק ו electroporated. אני בדרך כלל electroporate 4-8 עוברים לכל אמא, בהתאם לכמות ה-DNA, מספר העוברים, מצבם של האם, את כמות הזמן תחת הרדמה. לחלופין, עוברים מרובים ניתן להזריק ו electroporated אז, בניגוד הזרקת ו electroporating כל העובר בנפרד. לאחר electroporating את העוברים, השתמש מלקחיים מרית כדי להחליף את השרשרת עובריים חזרה לתוך חלל הבטן. יוצקים ~ 2 מ"ל של תמיסת אנטיביוטיקה antimycotic לתוך חלל הבטן. השתמש hemostat ו מלקחיים אל תפר הצפק, החל בקשר כפול על החלק הקדמי של החתך ולהמשיך עם דפוס תפר פשוט מתמשכת לחלק האחורי של החתך. השתמש לולאה סופית לקשור את תפר תפר ואת עודף לקצץ. כדי להדק החתך נסגר, להרים את העור על החלק הקדמי של החתך עם מלקחיים בוטה, נזהר להפריד את העור מפני הצפק. מניחים את השיניים של מהדק סביב העור לדכא את המהדק. המשך הידוק החתך נסגר עד הסוף האחורי, אשר בדרך כלל דורש סיכות 5-7. נגבו את הפצע סביב סיכות עם כרית אלכוהול. בואו לאם להתאושש על כרית חימום (בדרך כלל לוקח בין 15-90 דקות לה להתעורר) וכאשר היא מתחילה להתהפך, את מקומה לצד כלוב חדש הבטן למעלה. כדי למזער את כאב ואי נוחות, אמהות לקבל עצירות (0.05-0.1 מ"ג / ק"ג, sc) על התעוררות, ובאותו זמן מאוחר יותר נקודות אם אי הנוחות ממשיכה. כדי למנוע התייבשות, להזריק את אמא עם 1.0 מ"ל תמיסת מלח תת עורית (SC) ~ 2-4 שעות שלאחר הניתוח, ושוב אם ערב למחרת במידת הצורך. 24 שעות לאחר הניתוח, האם צריך להחזיר את התנהגות נורמלית ולהיות שתייה ואכילה באופן קבוע. 2B חלק: ב אחזור electroporation ברחם ברשתית הרשתית electroporated ב E18.5 הכן paraformaldehyde 4% (PFA) ב-PBS, מה שהופך ~ 5 מ"ל לכל העובר. Perfusions ניתן לעשות עם מערכת הכבידה מבוססי עירוי או משאבת מזרק. (לחלופין, E18.5 ראשי יכול להיות פשוט שקוע PFA 4% בין לילה.) להזריק את אמא עם0.2 מ"ל של חומר הרדמה לערבב ip ולהבטיח כי היא בהרדמה מלאה. השתמש במספריים לחתוך את העור הצפק מתחת סיכות לחשוף את חלל הבטן וקרניים הרחם. הסר עובר electroporated ומהדקת אותו בצד הגחון למעלה. לחתוך את המנות, עור הצפק, הסרעפת לרוחב הבטן של בית החזה כדי לחשוף את הלב. פירס החדר השמאלי עם מחט פרפר המצורפת ההתקנה זלוף, וחתך את אטריום ימין עם microscissors. הפעל את זלוף ולאפשר PFA לזרום עבור ~ 60 שניות; דם צריך לצאת אטריום ימין העובר צריך להיות בהיר זלוף אם הוא מוצלח. לערוף את העובר ולאסוף ראש PFA 4% בקבוקון 15 מ"ל, חרוטי. חזור על הליך זה עבור כל עוברי electroporated. שמור ראשי PFA ב -4% הלילה בשעה 4 ° C, ולאחר מכן לשטוף ב PBS במשך כמה ימים. האם להרדים באמצעות פריקה צוואר הרחם, כאשר כל עוברי נאספים. הסרת הרשתית לאחר שוטף PBS, סיכת הראש בצלחת דיסקציה עם הרשתית כלפי מעלה ואת לטבול PBS. הסרת העור סביב הרשתית כדי לחשוף את הרשתית. באמצעות מחט 26G1 / 2, לנקב את הרשתית הגחון בצומת עדשה הרשתית. הכנס קצה אחד של microscissors לתוך החור הזה ולעשות חתך אנכי דרך הרשתית הגחון על דיסק אופטי. זה יאפשר לך לכוון את הרשתית, כאשר אתה מסיר אותו. הסר את הרשתית עם קנס נקודות מלקחיים. תפוס את הרשתית בכל חתך הגחון עם מלקחיים להשתמש במלקחיים אחרים לקלף הרשתית הרחק הרשתית, במיוחד בצומת הרשתית, העדשה שבה הרשתית מחובר כהלכה. לאחר הסרת הרשתית, לתפוס את העדשה עם מלקחיים בסדר מתרחקת להסיר את העדשה. הסר הרשתית על ידי הצבת מלקחיים סביב ראש עצב הראייה ולצבוט את הרשתית. העברת הרשתית ל PBS מלא טוב, שמירה על מסלול של רשתיות אשר באו ממנה ראשים. חזור על שלבים 4-5 עבור הרשתית הנגדי, ועל כל עוברי electroporated אחרים. הרשתית לא מוזרק משמש לשלוט על immunostaining. שימוש במיקרוסקופ לנתח ניאון כדי לסרוק את כל רשתיות עבור ה-GFP בתאים + (ירוק רשתיות). לכל + GFP רשתיות, electroporation הצליחה בעובר זה, אלה במוח רשתיות לבין המקביל (עם מערכת הראייה שלם) יכול להיות מעובד לניתוח נוסף (כלומר, חתך ו immunostaining) (איור 1). חלק 3a: electroporation Ex vivo ו electroporating רשתית הזרקת DNA לתוך רשתיות E14.5 Murine במבחנה הרדימי אמא E13.5-E14.5 הבמה עם 0.2 מ"ל של תערובת הרדמה להבטיח כי היא בהרדמה מלאה. השתמש במספריים לחתוך עור חלל הבטן לחשוף עוברי. הרם את שרשרת עובריים עם מלקחיים ולחתוך רקמת החיבור במלואה להסיר שרשרת עובריים כולו מהאם. המקום שרשרת עובריים בצלחת פטרי עם DMEM/F12 על הקרח. האם להרדים באמצעות פריקה צוואר הרחם. חותכים דרך דופן הרחם כולו microscissors. ואז להשתמש במלקחיים כדי להסיר כל העובר מתוך שק השפיר קמצוץ לסירוגין השליה. לערוף את כל העובר ולאסוף ראשי בצלחת פטרי נוספת עם DMEM/F12 על הקרח. שימוש pipet הפה או pipet הבוכנה, למלא micropipette עם כמות הרצויה של פתרון ה-DNA (ראה פרק 1). בפרוטוקול זה, ה-DNA יהיה להזריק לתוך הרשתית הגב היקפי. אפשר למקד לאזורים אחרים ברשתית ידי התאמת הזרקת DNA האתר ואת המיקום של משוטים אלקטרודה. העברת ראש אחד לצלחת לנתח עם PBS ואת הסיכה בצד הגב ראש למעלה. שימוש במלקחיים כדי להסיר עור מעל הרשתית. החזקת micropipette ~ 10 ° ממצב אופקי (מקביל במהותו העקמומיות של הרשתית הגבי), לדחוף micropipette דרך הרשתית, כך הטיפ הוא בין הרשתית ואת השכבה החיצונית של הרשתית. לגרש ~ 0.1-0.4 פתרון ה-DNA μl לחלל זה; נוזל ירוק צריך להיות הנצפה מילוי החלל כולו דולף החוצה דרך החור של הרשתית. חזור על זריקה של הרשתית הנגדי. בזהירות אך במהירות להסרת סיכות (ראש שמירה שקוע PBS) אלקטרודה מקום משוטים סביב הראש, עם ההנעה (+) חיובי בצד הגחוני של הראש. העברת 4 40-V, 50 ms פולסים בתדירות של 60 הרץ, אז במקום הראש בחזרה לתוך צלחת עם DMEM/F12 על הקרח (איור 2). חזור על שלבים 5-7 עבור כל ראשי ולתמיד פתרונות ה-DNA. לאחר השלמת electroporations, להוסיף ~ 1.5 מ"ל של פתרון SFM מחומצן אל צלחת 4-באר ולשמור על הקרח (אחד טוב עבור כל פתרון ה-DNA שונה מוזרק). העברת ראש אחד לצלחת לנתח עם DMEM/F12, עם אחד הרשתית כלפי מעלה. על הרשתית הגחוני (או באזור מול בצד היעד), להשתמש במלקחיים בסדר לצבוטודמעה חור הרשתית. הכנס קצה אחד של המלקחיים דרך החור הזה לקלף הרשתית הרחק הרשתית, במיוחד בצומת עדשה הרשתית. אין לחתוך או לנזק ברשתית כי זה יגרום לקריסת הרשתית על עצמה במהלך הדגירה. לאחר הסרת הרשתית, להשתמש במלקחיים יצוץ הרשתית על ידי עצב הראייה צובט בבסיס של הרשתית (להשאיר את העדשה ללא פגע). העברת רשתיות כדי SFM מחומצן. פליפ מעל הראש וחזור עין הנגדי. השלמת שלב 9 עבור כל ראשי electroporated. דגירה של הרשתית SFM מחומצן על 37 מעלות צלזיוס במשך 40-48 שעות. חלק 3b: אקס מסיק vivo electroporation הרשתית ציפוי של ה-GFP + explants הרשתית (2 ימים שלאחר electroporation) העברת כל רשתיות מאחד היטב SFM מחומצן לתוך מכסה צלחת פטרי עם DMEM/F12. בחר אחד הרשתית ולהשתמש היקף הניתוחים פלורסנט לדמיין GFP + (ירוק) החלק של הרשתית. שימוש microscalpel ו מלקחיים, לנתח ולסלק הלא GFP + חלק של הרשתית, כך שרק GFP + נתח של הרשתית נשאר. זה עוזר הרף לעבור בין אור ניאון קבוע לאורך לנתיחה כדי לבחור באופן ספציפי את ה-GFP + הרשתית. מעבירים את ה-GFP + הרשתית היטב עם DMEM/F12. חזור על שלב 2 עבור כל אחד הרשתית היטב. עבור כל תנאי ה-DNA (כל אחד טוב שונה), יש להשתמש בצלחת פטרי חדש DMEM/F12 בינוני. + אלה GFP רשתיות כעת יש explants גזור לתוך הרשתית קטן עבור ציפוי. תחת בהיקף לנתח, לחתוך חתיכה גדולה של הרשתית + GFP לתוך explants קטן עם microscalpel. Explants צריך להיות מלבני, ~ 200-300 מיקרומטר אורך ורוחב. לאסוף את כל explants היטב עם DMEM/F12. אחת GFP + נתח של הרשתית צריך לייצר ~ GFP 4-10 + explants רשתית, בהתאם לגודל רקמות. חזור על שלב זה עבור ה-GFP + כל האזורים ברשתית אשר נבצרו. לאחר הכנת כל GFP + explants רשתית, להוסיף 250 μl של SFM methylcellulose + 0.4% (כל הזמן ב 4 ° C) עד laminin מצופה מנות התרבות (ראה פרק 1). העברת 4-8 GFP + explants כדי בצלחת תרבות להשתמש במלקחיים כדי לסדר את explants בעדינות לתוך מצולע, עם explants ממוקם באמצע הדרך בין המרכז לבין קצה המנה. לקבוע באיזה צד של explant היא שכבה RGC. לפעמים גבישים הרשתית להישאר מחוברת שכבת הרשתית החיצונית, המציין כי הצד הנגדי היא שכבת RGC. בנוסף, הצד RGC בדרך כלל יש כמה פסולת תאית יכולה לסייע בכיוון הנכון explant. עם שכבת RGC למטה, להשתמש במלקחיים כדי לדכא בתקיפות את מרכז explant כך תדבק coverslip הזכוכית. הכניסה ב explant מן מלקחיים יכול להיות גלוי, זה נורמלי. לאחר ציפוי כל explants על צלחת תרבות, להעביר 37 ° C חממה. אקסונים רשתית הם נצפתה לראשונה 4-6 שעות לאחר ציפוי explants להישאר בריאים במשך כמה ימים, אבל יתר משמעותי יכול להתרחש לאחר 24 שעות. Explants יכול לשמש עבור רבים מבחני חוץ גופית, קבוע עם PFA 4% במשך 30 דקות ו immunostained (איור 2). הגבול Assay לחלופין, להעביר GFP 4 + explants לצלחת כי הוכן assay את הגבול (ראו חלק 1). מסדרים את explants בקו אנכי במרכז צלחת, המתקרבות את מיקומו של הגבול. תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי צלחת לנתח, explants כך הם ~ 50-150 מ"מ מהגבול ניאון. דגירה מנות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות, מה שמאפשר מספיק זמן עבור אקסונים RGC להגיע המצע הגבול. Explants ניתן לתקן PFA ב -4% במשך 30 דקות, ואחריו immunostaining (איור 2). נציג תוצאות