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In Vitro dirigió la evolución de una endonucleasa de restricción con una especificidad más estricta
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In Vitro Directed Evolution of a Restriction Endonuclease with More Stringent Specificity
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In Vitro dirigió la evolución de una endonucleasa de restricción con una especificidad más estricta

DOI:
10.3791/60807-v

•

09:16 min

•

March 25, 2020

•

,
1International Institute of Molecular and Cell Biology, Warsaw (IIMCB)

Chapters

  • 00:05Introduction
  • 00:49Split-and-Mix Synthesis of Mutagenic Primers
  • 02:34Performing Compartmentalized In Vitro Transcription-translation Reaction
  • 05:07Continued Processing of Libraries and Selection
  • 07:20Results: Examples of Screening of NlaIV Variants for Sequence Specificity Alteration
  • 08:16Conclusion

Summary

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Las endonucleasas de restricción con nueva especificidad de secuencia se pueden desarrollar a partir de enzimas que reconocen una secuencia parcialmente degenerada. Aquí proporcionamos un protocolo detallado que utilizamos con éxito para alterar la especificidad de la secuencia de la enzima NlaIV. Los ingredientes clave del protocolo son la compartimentación in vitro de la reacción de transcripción/traducción y la selección de variantes con nuevas especificidades de secuencia.

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Keywords: In Vitro Directed EvolutionRestriction EndonucleaseSequence SpecificityIn Vitro CompartmentalizationDirected EvolutionSubsaturation MutagenesisOligonucleotide SynthesisOil Surfactant MixtureLibrary Preparation

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