Ensaios de Co-Imunoprecipitação e Pull-Down
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概述
Os ensaios de co-imunoprecipitação (CoIP) e pull-down são métodos intimamente relacionados para identificar interações proteína-proteína estáveis. Esses métodos estão relacionados à imunoprecipitação, um método para separar uma proteína alvo ligada a um anticorpo de proteínas não ligadas. No CoIP, uma proteína ligada a anticorpos está ligada a outra proteína que não se liga ao anticorpo, isso é seguido por um processo de separação que preserva o complexo proteína-proteína. A diferença nos ensaios puxados para baixo é que as proteínas de isca marcadas por afinidade substituem anticorpos, e a cromatografia de afinidade é usada para isolar complexos proteína-proteína.
Este vídeo explica coip, ensaios pull-down, e sua implementação em laboratório. Um protocolo passo-a-passo para cada técnica é coberto, incluindo os reagentes, aparelhos e instrumentos usados para purificar e analisar proteínas ligadas. Além disso, a seção de aplicações deste vídeo descreve um procedimento para estudar como as proteínas do micovírus inibem a nucleoproteína da gripe, uma investigação sobre o papel dos íons de cálcio na calmodulina através de um ensaio de puxar para baixo, e um ensaio de puxar para baixo modificado para caracterizar interações proteicas transitórias.
As interações proteína-proteína desempenham um papel significativo em uma grande variedade de funções biológicas. A maioria das interações proteína-proteína e seus efeitos biológicos ainda não foram identificados. A co-imunoprecipitação, ou CoIP, e ensaios puxados para baixo são dois métodos intimamente relacionados para a identificação de interações proteína-proteína estáveis. Este vídeo abordará os princípios dos dois ensaios, seus procedimentos laboratoriais gerais e aplicações dessas técnicas.
Os ensaios coIP e pull-down são variantes da imunoprecipitação, um método para isolar seletivamente uma espécie proteica de uma solução complexa. Em um experimento de imunoprecipitação, um anticorpo específico para uma proteína alvo é permitido formar um complexo imunológico com esse alvo na amostra. O complexo é então capturado em um suporte sólido, tipicamente proteína A ligada a uma conta de sepharose. Quaisquer proteínas não capturadas são removidas por etapas de centrifugação. A proteína é então liberada do anticorpo e suporte sólido, fervendo na redução do buffer de carga amostral SDS-PAGE.
A co-imunoprecipitação é conduzida da mesma forma, exceto que complexos proteicos intactos são capturados no suporte sólido. O anticorpo se liga à proteína alvo, que, por sua vez, está ligada a outra proteína que não é alvo do anticorpo. Como na imunoprecipitação, o complexo proteico é liberado do anticorpo e suporte sólido, fervendo na redução do buffer de carga de amostras SDS-PAGE.
Os ensaios de recuo são semelhantes à co-imunoprecipitação, diferindo apenas no uso de uma proteína “isca”, em oposição a um anticorpo. Através de técnicas de biologia molecular, essa proteína de isca é projetada com uma etiqueta de afinidade, como uma série de resíduos de histidina. Essas etiquetas de afinidade são descritas em “Separações biomoléculas baseadas em cromatografia”. A proteína é então capturada em um ligante de afinidade imobilizado específico para a tag. A proteína capturada é então incubada com uma amostra que contém proteínas que formam complexos com a “isca”. O complexo proteico é liberado do suporte de afinidade por meio da lavagem com uma solução contendo um analito competitivo específico para a tag na proteína “isca”. Ensaios puxados para baixo são úteis para confirmar interações proteicas previstas pela co-imunoprecipitação, e para descobrir interações proteicas desconhecidas.
Agora que os princípios da co-imunoprecipitação e dos ensaios de retirada foram discutidos, vamos olhar para seus procedimentos laboratoriais.
Primeiro vamos discutir a co-imunoprecipitação. Para uma série de tubos de microfuge, acrescenta-se: tampão PBS, e uma solução de 50% de proteína A-sepharose, um complexo de proteína de resina que se liga ao anticorpo. Os tubos de microfuge são girados para garantir a distribuição adequada e, em seguida, a resina é lavada com tampão PBS adicional. O linsato celular, contendo a proteína desejada, e 2 μg de anticorpo são adicionados aos tubos de microfuça, e a mistura é girada por 1h a 4 °C. As contas são pelotas por centrifugação, o sobrenante é descartado, e as contas relavadas três vezes com tampão para remover proteínas não ligadas. As contas que contêm o complexo anticorpo-proteína estão na redução do buffer de carga amostral SDS-PAGE, para remoção do complexo do anticorpo e para análise por SDS-PAGE e imunoblotting.
Agora discutiremos o procedimento para ensaios de retirada: A proteína “isca” é expressa em um plasmídeo com a etiqueta de afinidade apropriada. Depois de atingir o crescimento da fase de registro, as células são diluidas e, em seguida, centrifadas. As contas de streptavidin-sepharose suspensas, que capturam proteína “isca” marcada por biotina, são insustadas em um tubo de microfuge. As contas são então centrifadas e o supernatante cuidadosamente removido por aspiração. As contas são então lavadas com tampão, centrifugadas e removidas pelo supernatante.
As células que contêm a proteína putativa “presa”, que tem afinidade com a proteína “isca”, são colhidas por centrifugação. O supernascer é então adicionado ao tubo de microfuge contendo a resina, e incubado a 4 °C por 3 h em um shaker. A resina é então centrifugada, o supernacido removido, e a resina lavada para remover proteínas não ligadas. O tampão de elução é adicionado à resina, e a mistura é incubada à temperatura ambiente por 30 minutos em um shaker. A resina é então centrifugada, e o supernatante contendo o complexo desejado é analisado por imunoblotação.
Agora que revisamos os procedimentos, vamos ver algumas das aplicações úteis de co-imunoprecipitação e ensaios puxados para baixo.
A co-imunoprecipitação pode ser útil na melhor compreensão do mecanismo de ação das enzimas. As proteínas de resistência myxovirus- ou Mx-, inibem uma ampla gama de vírus, incluindo a influenza A, para a qual o mecanismo é mal compreendido. A co-imunoprecipitação foi utilizada para estudar a interação entre a proteína Mx1 do camundongo e a nucleoproteína da gripe.
Os ensaios puxados para baixo têm se mostrado úteis no estudo dos efeitos dos segundos mensageiros, que são proteínas que comunicam um sinal do ambiente celular. Eles são um componente de uma via de sinalização onde múltiplas proteínas interagem em resposta a pistas ambientais. Os íons de cálcio atuam como mensageiros secundários, vinculando-se à calmodulina, que, por sua vez, se liga a uma grande variedade de proteínas, mediando muitos tipos de respostas biológicas. Sem o cálcio, a proteína não pode se ligar à calmodulina. Um ensaio puxado para baixo foi realizado para testar a capacidade das proteínas de se ligarem à calmodulina na presença ou ausência de íons de cálcio.
Ensaios de co-imunoprecipitação e pull-down são geralmente usados para analisar interações proteicas estáveis ou fortes, mas não transitórias. Um desenvolvimento recente em ensaios puxados para baixo, o HaloTag, simplificou o estudo de interações proteicas transitórias; HaloTag é uma etiqueta de fusão de proteínas geneticamente codificada, fundida à proteína de interesse, capaz de reagir quimicamente com um suporte sólido haloalkane. Se a análise funcional for desejada, o complexo proteico, menos a tag, em sua totalidade poderia então ser isolado incubando com protease do vírus da etch do tabaco.
Você acabou de assistir o vídeo de JoVE sobre co-imunoprecipitação e ensaios puxados para baixo. Este vídeo descreveu os princípios dos dois métodos, os procedimentos laboratoriais gerais e algumas de suas aplicações.
Obrigado por assistir!
Procedure
Disclosures
成績單
Protein-protein interactions play a significant role in a wide variety of biological functions. The majority of protein-protein interactions and their biological effects have yet to be identified. Co-immunoprecipitation, or CoIP, and pull-down assays are two closely related methods for the identification of stable protein-protein interactions. This video will cover the principles of the two assays, their general laboratory procedures, and applications of these techniques.
CoIP and pull-down assays are variants of immunoprecipitation, a method for selectively isolating a protein species from a complex solution. In an immunoprecipitation experiment, an antibody specific to a target protein is allowed to form an immune complex with that target in the sample. The complex is then captured on a solid support, typically protein A bound to a sepharose bead. Any proteins not captured are removed by centrifugation steps. The protein is then released from the antibody and solid support by boiling in reducing SDS-PAGE sample-loading buffer.
Co-immunoprecipitation is conducted in the same manner, except that intact protein complexes are captured onto the solid support. The antibody binds to the target protein, which, in turn, is bound to another protein that is not targeted by the antibody. As in immunoprecipitation, the protein complex is released from the antibody and solid support by boiling in reducing SDS-PAGE sample loading buffer.
Pull-down assays are similar to co-immunoprecipitation, differing only in the use of a “bait” protein, as opposed to an antibody. Through molecular biology techniques, this bait protein is engineered with an affinity tag, such as a series of histidine residues. These affinity tags are described in “Chromatography-based Biomolecule Separations.” The protein is then captured on an immobilized affinity ligand specific for the tag. The captured protein is then incubated with a sample that contains proteins that form complexes with the “bait”. The protein complex is released from the affinity support by washing with a solution containing a competitive analyte specific for the tag on the “bait” protein. Pull-down assays are useful for confirming protein interactions predicted by co-immunoprecipitation, and for discovering unknown protein interactions.
Now that the principles of co-immunoprecipitation and pull-down assays have been discussed, let’s look at their laboratory procedures.
First let’s discuss co-immunoprecipitation. To a series of microfuge tubes, the following is added: PBS buffer, and a 50% solution of protein A-sepharose, a resin-protein complex that binds to the antibody. The microfuge tubes are rotated to ensure proper distribution, and then the resin is washed with additional PBS buffer. Cell lysate, containing the desired protein, and 2 μg of antibody are added to the microfuge tubes, and the mixture is rotated for 1 h at 4 °C. The beads are pelleted by centrifugation, the supernatant is discarded, and the beads re-washed three times with buffer to remove non-bound protein. The beads containing the antibody-protein complex are in reducing SDS-PAGE sample-loading buffer, for removal of the complex from the antibody and for analysis by SDS-PAGE and immunoblotting.
Now we will discuss the procedure for pull-down assays: The “bait” protein is expressed in a plasmid with the appropriate affinity tag. After reaching log-phase growth, the cells are lysed, and then centrifuged. Suspended streptavidin-sepharose beads, which capture biotin-tagged “bait” protein, are pipetted into a microfuge tube. The beads are then centrifuged and the supernatant carefully removed by aspiration. The beads are then washed with buffer, centrifuged, and the supernatant removed.
Cells containing the putative “prey” protein, which has an affinity for the “bait” protein, are harvested by centrifugation. The supernatant is then added to the microfuge tube containing the resin, and incubated at 4 °C for 3 h on a shaker. The resin is then centrifuged, the supernatant removed, and the resin washed to remove non-bound protein. Elution buffer is added to the resin, and the mixture is incubated at room temperature for 30 min on a shaker. The resin is then centrifuged, and the supernatant containing the desired complex is analyzed by immunoblotting.
Now that we’ve reviewed the procedures, let’s look at some of the useful applications of co-immunoprecipitation and pull-down assays.
Co-immunoprecipitation can be useful in better understanding of enzymes’ mechanism of action. Myxovirus-, or Mx-, resistance proteins inhibit a wide range of viruses, including influenza A, for which the mechanism is poorly understood. Co-immunoprecipitation was used to study the interaction between mouse Mx1 protein and influenza nucleoprotein.
Pull-down assays have proven useful in studying the effects of second messengers, which are proteins that communicate a signal from the cellular environment. They are a component of a signaling pathway where multiple proteins interact in response to environmental cues. Calcium ions act as secondary messengers by binding to calmodulin, which, in turn, binds to a wide variety of proteins, mediating many types of biological responses. Without the calcium, the protein can’t bind to the calmodulin. A pull-down assay was conducted to test the ability of proteins to bind to calmodulin in the presence or absence of calcium ions.
Co-immunoprecipitation and pull-down assays are generally used for analyzing stable or strong protein interactions, but not transient ones. A recent development in pull-down assays, the HaloTag, has simplified the study of transient protein interactions; HaloTag is a genetically-encoded protein fusion tag, fused to the protein of interest, capable of chemically reacting with a haloalkane solid support. If functional analysis is desired, the protein complex, minus the tag, in its entirety could then be isolated by incubating with tobacco etch virus protease.
You’ve just watched JoVE’s video on co-immunoprecipitation and pull-down assays. This video described the principles of the two methods, the general laboratory procedures, and some of their applications.
Thanks for watching!
