Lo screening per aggregazione amiloide di semi-denaturazione detergente-Agarosio elettroforesi su gel

Parte 1: Preparazione del gel Montare il vassoio di colata gel. Di serie per elettroforesi DNA orizzontali possono essere utilizzati. Per un gran numero di campioni, ci prepariamo a 20 cm x 24 cm lastra con fino a quattro 50-pettini bene. Assicurarsi che la lastra non ha graffi, come questi possono distorcere l'immagine macchia. Creare una soluzione di agarosio 1,5% (media o alta forza di gel, a basso EEO) in TAE 1X. Il volume dovrebbe essere sufficiente per sommergere completamente i denti pettine – si desidera caricare campione il più possibile per massimizzare il rilevamento. Microonde l'impasto fino a quando il agarosio è completamente sciolto. Si possono aggiungere rapidamente SDS allo 0,1% da uno stock del 10%. Mescolare. Se alcuni di agarosio si solidifica in questa fase, scioglierla con un piatto caldo e stare attenti per evitare di ebollizione. Versare la soluzione nel cassetto casting. Usare un pettine a rastrello eliminare le bolle, come si potrebbe poi interferire con il trasferimento. Dopo gel ha stabilito, pettini rimuovere e posizionare il gel nel serbatoio gel. Immergere completamente il gel in TAE 1X contenente 0,1% SDS. Parte 2: Preparazione dei campioni Per high-throughput analisi dei lisati di lievito, si comincia con 2 ml culture cresciute durante la notte con l'agitazione rapida da 96 pozzetti blocchi. In questo caso, ogni cultura è sovraesprimono una proteina di interesse. Quando si analizzano le proteine ​​poco abbondanti, grandi volumi di coltura deve essere utilizzato Celle di raccolta per centrifugazione a 2000 RCF per 5 minuti a temperatura ambiente. Risospendere le cellule in acqua e centrifugare di nuovo. Risospendere in 1 ml di soluzione spheroplasting. Incubare per circa 30 minuti a 30 ° C (si può confermare l'efficienza spheroplasting al microscopio). Centrifugare a 800 RCF per 5 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere completamente il surnatante. Risospendere sferoplasti pellet in 100 ml di tampone di lisi. Coprire il blocco con nastro e vortice ad alta velocità per 2 minuti. Pellet residui cellulari a 4000 RCF per 2 minuti. Rimuovere con cura il supernatante in un nuovo contenitore, ad esempio, una piastra a 96 pozzetti PCR. Se lo si desidera, determinare la concentrazione di proteine ​​del lisati. Aggiungi tampone 4X campione per i campioni di generare lisati contenente 1X tampone del campione. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. Carico gel. Se lo si desidera, salvare la metà del volume del campione e bollire per SDS-PAGE analisi. Al fine di monitorare l'entità del trasferimento in seguito, dotati di un pre-colorato SDS-PAGE marcatore. Inoltre, un marcatore di peso molecolare costituita da proteine ​​molto grandi (ad esempio, pollo pettorale estratto) può essere utilizzato per stimare le dimensioni dei complessi risolto. Funzionare a bassa tensione (≤ 3 V / cm lunghezza gel) fino a quando il fronte del colorante raggiunge ~ 1 cm dalla fine del gel. Questo richiederà parecchie ore. E 'importante che il gel rimangono fredde, altrimenti la diffusione di proteine ​​a basso peso molecolare (ad esempio, monomeri) possono limitare la loro rilevazione. Parte 3: Trasferimento Tagliare un pezzo di nitrocellulosa per le stesse dimensioni del gel. Taglio di 20 pezzi GB004 e GB002 8 pezzi di carta assorbente, per le stesse dimensioni del gel. Tagliare un pezzo aggiuntivo di GB004 per essere usato come uno stoppino, ne fanno circa 20 centimetri più largo del gel. Immergere la nitrocellulosa, stoppino, e 4 pezzi di GB002 in TBS 1X. In un contenitore di plastica, assemblare una pila di fogli come segue: 20 pezzi di secco GB004, poi 4 pezzi di GB002 secco, poi un pezzo di pre-umido GB002. Stendere la nitrocellulosa in cima a questo stack. Sciacquare il gel brevemente sulla barra di colata in acqua per rimuovere l'eccesso tampone di corsa. Poi, con attenzione cominciano a far scorrere il gel fuori dal cassetto nello stack. Facendo scorrere il gel fuori dal cassetto, bagnare la membrana con TBS, se necessario. Il buffer in più aiuta a prevenire le bolle di diventare intrappolato sotto il gel. Una pipetta di trasferimento funziona bene per questo scopo. Dopo che il gel è stata spostata la pila, controllare accuratamente per bolle. Se presenti, sollevare il bordo del gel e riapplicare buffer finché le bolle possono essere risolte. Mettere i restanti tre pre-bagnate GB002 pezzi sulla parte superiore del gel. Garantire un perfetto contatto tra tutti i livelli facendo rotolare una pipetta saldamente nella parte superiore dello stack. Fiancheggiano la pila di trasferimento con due vaschette contenenti TBS. Far passare il pre-stoppino bagnato tutto lo stack in modo tale che entrambe le estremità dello stoppino è immerso in TBS. Coprire la pila trasferimento assemblato con un vassoio di plastica ulteriore cuscinetto di peso in più (per esempio, un flacone da 500 ml di acqua). Consentire il trasferimento di procedere per un minimo di tre ore, o durante la notte. Dopo il trasferimento, la membrana possono essere elaborati da standard di Western blotting. Soluzione Spheroplasting 1,2 M D-sorbitolo 0,5 mM MgCl 2 20 mM Tris, pH 7,5 50 mM BME (aggiungere fresco) 0,5 mg / ml Zymolyase 100T (aggiungere fresco) coration: underline; "> Lysis Buffer 100 mM Tris 7,5 50 mM NaCl 10 mM BME (aggiungere fresco) inibitori della proteasi (aggiungere fresco) Sample Buffer 4X 2X TAE 20% di glicerolo 8% SDS blu di bromofenolo alle preferenze