该协议描述了使用基因组编辑技术以精确、高效和技术简单的方式设计培育抗性淀粉稻品种。
传统的作物育种方法主要依赖于耗时和劳动密集型的方法,例如传统的杂交和突变育种,在有效引入目标性状和产生多样化的植物种群方面面临挑战。相反,基因组编辑技术的出现带来了范式转变,能够精确和快速地操作植物基因组,从而有意识地引入所需的特征。CRISPR/Cas 系统是应用最广泛的编辑工具之一,研究人员已使用它来研究重要的生物学相关问题。然而,在作物育种中,基因组编辑的精确和有效的工作流程尚未得到明确定义。在这项研究中,我们展示了培育富含高水平抗性淀粉 (RS) 的水稻品种的整个过程,这种功能性状在预防糖尿病和肥胖等疾病中起着至关重要的作用。该工作流程包括几个关键步骤,例如选择功能性 SBEIIb 基因、设计单向导 RNA (sgRNA)、选择合适的基因组编辑载体、确定载体递送方法、进行植物组织培养、基因分型突变和表型分析。此外,还清楚地证明了该过程每个阶段所需的时间框架。该方案不仅简化了育种过程,还提高了性状引入的准确性和效率,从而加速了功能性水稻品种的开发。
传统育种依赖于将性状引入作物或产生具有足够变异的植物种群,这需要长期的田间观察 1,2。由于传统育种的局限性,已经开发了基因编辑技术,该技术可以精确修饰作物的基因组以获得植物种群所需的性状3。植物中使用最广泛的基因编辑系统是 CRISPR/Cas(成簇规则间隔短回文重复序列/CRISPR 相关 Cas 核酸内切酶),它依赖于可编程的 RNA 引导的核酸内切酶在 DNA 中产生靶向双链断裂 (DSB) 4,5。然后,这些 DSB 被细胞的天然 DNA 修复机制修复 6,7,通常会导致引入所需的遗传变化。尽管这项技术已经在各种作物中实施,包括小麦8、玉米9、大豆10 和水稻11,但它主要用于揭示生物学问题。与其在阐明植物基因功能方面的广泛应用相比,将基因编辑技术应用于作物育种的研究仍然相对稀少12。
作物中的基因编辑过程通常遵循一个明确的工作流程,其中包括几个关键步骤13。第一步涉及确定需要修饰以实现所需性状的特定基因或遗传区域。其次,设计基因编辑策略,包括选择合适的基因编辑系统(例如 CRISPR-Cas9 或 CRISPR-Cas12)和设计特异性向导 RNA 以将核酸内切酶引导至靶位点。其次,然后将基因编辑系统整合到递送载体中,用于将编辑机制引入植物细胞。这些载体可以是 DNA、RNA 或核糖核蛋白 (RNP) 复合物。随后,使用各种方法将基因编辑载体递送到植物细胞中,包括 农杆菌介导的转化、粒子轰击或电穿孔。立即在适当的条件下培养转化的植物细胞,以产生基因编辑的愈伤组织或胚胎发生组织。然后通过组织培养技术将这些组织再生成整株植物。再生植物经过严格的分子表征,以确认所需遗传变化的存在。
Tsakirpaloglou 等人的前一篇文章14 对基因编辑过程进行了广泛的概述,从载体设计到编辑幼苗的生成,但它没有深入研究与目标基因相关的特定性状的详细分析,也没有深入探讨随后对农艺性能的评估或编辑作物的功能验证。我们已经超越了简单地证明在水稻中编辑基因的可行性。我们的工作全面评估了这种编辑对编辑后水稻品系的生化、分子和农艺性状的影响。这包括评估淀粉组成,淀粉组成是影响谷物质量和营养价值的关键因素,这在以前的基因编辑研究中尚未得到广泛探讨。
大米淀粉通常由 ~20% 的直链淀粉和 ~80% 的支链淀粉15 组成。SBEIIb 是支链淀粉合成所必需的酶,在胚乳16 中表达。发夹 RNA (RNAi) 和 microRNA 表达敲低 OsSBEIIb 增加了抗性淀粉含量17,18。抗性淀粉是一种底物淀粉,不能在小肠中消化和吸收,但能够被肠道中的某些消化细菌分解成短链脂肪酸和气体。由于它不能迅速分解,因此与其他淀粉相比,它的升糖指数较低,并且在进食后短时间内不会引起血糖迅速升高,从而可以在一定程度上缓解糖尿病饮食19.此外,抗性淀粉具有更多的生理功能,如降低胰岛素反应、调节肠道功能、防止脂肪堆积、促进体重控制、促进矿质离子吸收等。因此,它作为一种新型膳食纤维20 受到广泛追求。
为了克服这些挑战并成功利用基因编辑技术培育功能性水稻品种,我们完善和优化了水稻中的操作方案。我们的重点是仔细分析靶基因位点的设计,精心选择最合适的基因编辑工具,并在整个育种过程中进行严格的表型分析。为了证明这些技术的强大功能和效率,我们提出了一个案例研究,展示了富含高抗性淀粉的功能性水稻品种的快速发展。这个例子强调了基因编辑在加速功能稻育种方面的潜力,解决了目前该领域研究的缺乏。
在构建基于 CRISPR/Cas-SF01 的敲低载体的过程中,单向导 RNA (sgRNA) 的精心选择至关重要。这需要采用具有高编辑效率和最小脱靶效应的序列。此外,靶向引物的合成结合了与载体剪接位点匹配的短接头寡核苷酸,确保无缝集成。值得注意的是,与以前需要顺序酶消化、凝胶纯化和连接的方法不同,我们的研究通过将酶切割和连接整合到一个一体化系统中来简化该过程。?…
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了生物育种重大项目 (2023ZD04074) 的资助。
2 x Taq Plus Master Mix II | Vazyme Biotech Co.,Ltd | P213 | Detecting Single Nucleotide Polymorphism (SNP) of genes |
2,4-Dichlorophenoxyacetic (2,4-D) Acid Solutio | Phyto Technology | D309 | |
AAM medium | Shandong Tuopu Biol-engineering Co., Ltd | M9051C | |
BsaI-HF | New england biolabs | R3535 | Bsa I enzyme digestion of the editing vector |
Carbenicillin antibiotics | Applygen | APC8250-5 | Selection medium, regeneration medium |
Casaminoacid | BBI-Life SciencesCorporation | A603060-0500 | Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium |
DH5α Chemically Competent Cell | Weidi Biotechnology Co., Ltd. | DL1001 | E. coli competent cells |
D-Sorbitol | BBI-Life SciencesCorporation | A610491-0500 | |
EDTA,disodium salt,dihydrate | Diamond | A100105-0500 | CTAB buffer |
EHA105 Chemically Competent Cell | Weidi Biotechnology Co., Ltd. | AC1010 | Agrobacterium competent cells |
FastPure Plasmid Mini Kit | Vazyme Biotech Co.,Ltd | REC01-100 | Plasmid isolated |
Hygromycin antibiotics | Yeasen | 60224ES | co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium and root medium |
Kanamycin antibiotics | Yeasen | 60206ES10 | Selection agrobacterium |
KOH | Macklin | P766798 | CTAB buffer |
L-Glutamine | Phyto Technology | G229 | Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium |
L-Proline | Phyto Technology | P698 | Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium |
Mautre dry rice seeds (Xiushui134) | – | – | Japonica varieties for breeding RS rice |
Mill rice mechine | MARUMASU | MHR1500A | To produce white rice |
Murashige Skoog | Phyto Technology | M519 | Root medium, regeneration medium |
Myo-inositol | Phyto Technology | I703 | Regeneration medium |
NaCl | Macklin | S805275 | For YEP media |
NB Basal Medium | Phyto Technology | N492 | Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium |
Peptone | Solarbio | LA8800 | For YEP media |
Phytogel | Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd | S24793 | |
Pot | Midea group Co. | MB-5E86 | For cooking rice |
Refrigerator | Haier | BCD-170 | Storage the medium |
Resistant Starch Assay Kit | Megazyme | K-RSTAR | Measurement and analysis resistant starch |
Rifampicin antibiotics | Sigma | R3501-250MG | Selection agrobacterium |
Sodium hypochlorite solution | Macklin | S817439 | For seed sterilization |
Sucrose | Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd | B21647 | Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium |
T4 DNA Ligase | New england biolabs | M0202 | Joining sgRNA to the CEISPRY/Cas-SF01 vector |
The glucose monitor | Medical Equipment & Supply Co., Ltd | Xuetang 582 | Detection the blood glucose |
Tris-HCL | Macklin | T766494 | CTAB buffer |
Yeast Agar | Solarbio | LA1370 | For YEP media |
YEP media | – | – | Cultivation of Agrobacterium |