Summary

马肠胶质细胞培养及其在马肠神经炎症机制研究中的应用

Published: October 04, 2024
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Summary

肠道胶质细胞因其在肠道稳态和疾病过程(包括术后并发症)中的作用而越来越受到认可。从紧急探查剖腹手术中恢复的马患者术后炎症风险很高,这凸显了建立可重复的马肠道神经胶质原代细胞培养用于研究的重要性。

Abstract

马绞痛(急腹症)的术后炎症不仅会导致客户成本增加、患者不适和住院时间增加,而且在许多情况下,事实证明会危及生命。肠道神经胶质细胞是一种独特的肠道细胞群,因其在感知胃肠道环境和与周围细胞类型交流方面的作用而日益得到认可。肠道胶质细胞和肠上皮细胞之间的相互作用可能被证明对于确定马肠道神经胶质细胞如何改变粘膜屏障以调节健康和绞痛中的炎症至关重要。

为了研究这种相互作用,我们提出了一种从马空肠建立原代马肠肠胶质细胞培养物并将培养物暴露于已知存在于绞痛中的炎症状况的方法。原代肠道神经胶质细胞培养物来自因与绞痛无关的原因而被安乐死的成年马。显微解剖肠绒毛和固有层,露出粘膜下层。分离的粘膜下层用胶原酶、蛋白酶和牛血清白蛋白进行酶消化 2-3 h。接下来,包括离心、移液和细胞过滤器 (40-100 μm) 的机械消解,得到用于在 0.05 mg/mL 聚-L-赖氨酸包被的孔上铺板的沉淀,浓度为 ~400,000 个细胞/300 μL 培养基。

汇合和第一次传代后,然后将肠胶质细胞暴露于马重组 IL-1β (0、10、25 ng) 24 小时。为了模拟绞痛时的上皮-胶质细胞相互作用,将对照或处理的肠胶质细胞调节的培养基直接添加到融合的马空肠单层中,同时使用双电极 EndOhm 室测量跨上皮电阻 (TEER)。这些数据只是马肠道神经胶质细胞培养的众多潜在有影响力应用之一。

Introduction

马绞痛是急诊会诊最常见的医疗主诉1。由于高达 17% 的马匹需要手术矫正,因此提高术后结果的努力应该是马医学研究的重中之重2。目前,术后绞痛患者患多种危及生命的疾病的风险很高,包括败血症/内毒素休克(12.3% 的患者)和术后肠梗阻(13.7% 的患者)3。尽管术后并发症的治疗取得了进展,但仍需要先进的治疗方法来预防或治疗这些疾病。

最近的研究强调了绞痛患者的局部和全身炎症状态4。例如,促炎蛋白,如肿瘤坏死因子 (TNF) α、白细胞介素 1β (IL-1β)、白细胞介素 6 (IL-6) 和单核细胞趋化蛋白-1,都已被证明在肠绞痛粘膜中的表达显著增加于正常肠组织4。从系统性的角度来看,已经证明肠道组织中 TNF α 的增加与术后鼻胃管反流大于 2 L 的风险增加相关,这是术后运动障碍的一般衡量标准4。众所周知,白细胞介素 IL-1β 和 TNF α 的给药能够诱导感染性休克的临床症状5

肠绞痛组织炎症状态及其与术后并发症联系的一个潜在解释是肠上皮屏障。在健康方面,连接肠道内衬单层柱状上皮的紧密连接复合物提供了功能屏障,以限制管腔内容物及其细菌成分到达粘膜下空间和血液。然而,与绞痛相关的肠梗阻和手术期间的肠道推拿引起的膨胀和损伤可能会破坏这种肠道屏障功能。

就整个肠壁的功能成分而言,肠神经系统内的粘膜下肠神经胶质细胞网络已被证明在与炎症途径相关的术后并发症的病理生理发展中至关重要,并可能提供特定的治疗靶点 6,7,8,9 .肠道胶质细胞不仅遍布整个胃肠道,而且它们充当肠道环境的传感器,影响肠壁多种细胞类型的信号传导,并直接调节肠道屏障6。因此,有理由假设这些有效的肠道传感器会因损伤和炎症而被激活,并可能产生急性反应,例如屏障通透性的改变。

这项研究首次描述了马肠道胶质细胞的培养,更具体地说,炎症性马肠道胶质细胞对肠道屏障功能的作用。在这里,我们介绍了马粘膜下肠道胶质细胞的原代培养方法及其对暴露于炎性 IL-1β 的反应,评估 IL-1β 暴露后肠胶质细胞产物对马肠上皮细胞单层通透性的影响,以及通过应用马血清可能进行的阻断。

Protocol

马肠道神经胶质原代培养物是从三匹马身上获得的,这些马因与本研究无关的原因而用过量的巴比妥酸盐人道地实施了安乐死。选择用于培养研究的马是目前没有胃肠道疾病史的成年马。 1. 马粘膜下肠道神经胶质原代培养 从三匹独立的成年马获得的空肠隐窝中生长马上皮单层。用涂层溶液在 37 °C 下包被 24 孔板 2 小时或在室温下过夜,用无菌水洗涤 2 次,并在室温下储存,直到细胞准备好进行电镀。 人道安乐死后,在 60 分钟内取出一段空肠并将其放入冰上的冷林格氏溶液中。 从空肠中取出 10 cm 的部分,并在肠系边界打开,以保持非淋巴区域位于组织中心。将部分修剪成大约 7 厘米 x 7 厘米的部分。解剖前用新鲜的林格氏液冲洗组织。 将组织固定在冷林格溶液或 PBS 粘膜面朝上的硅弹性体涂层培养皿上,尽可能拉伸组织(图 1A)。 用弯曲的镊子去除肠绒毛(图 1B),然后从大约 5 cm x 5 cm 的非淋巴区域去除固有层(图 1C)。注意:这些层很容易与粘膜下层分离(图 1B)。 用显微解剖剪刀在一个角落释放粘膜下层,将其去除一片粘膜,并在将粘膜下层从空肠的内圆形肌肉层剥离的同时观察自然分离(图 1D)。 将收集的粘膜下层切成 2-5 mm 的小块,然后放入含有 5 mL “有机胎牛血清表”(表 1)、0.825 mg 胶原酶、5 mg 蛋白酶和 20 mg 牛血清白蛋白的 50 mL 锥形管中。将组织在 37 °C 下孵育 2-3 小时以进行酶消化。 孵育后,加入 10 mL 室温“Organo + FBS”以停止酶的作用。用 10 mL 血清移液管上下移液组织混合物约 15 次,以将细胞从组织中解离,然后在室温下以 3,000 × g 离心 3 分钟。 弃去上清液,用 10 mL 室温 PBS 重悬沉淀,用 10 mL 血清移液管再次上下吹打约 15 次,以将细胞从组织中解离。 在室温下以 3,000 × g 离心锥形管 3 分钟。弃去上清液,用 10 mL 室温“Organo + FBS”重悬沉淀,用 10 mL 血清移液管上下吹打约 15 次,使细胞与组织分离。 通过 100 μm、70 μm 和 40 μm 孔径的细胞过滤器连续过滤细胞。 在室温下以 3,000 × g 离心过滤的细胞和培养基 3 分钟。弃去上清液,将沉淀重悬于 1 mL 的“Organo + FBS”中。 用台盼蓝染色以识别活细胞并用血细胞计数器计数。 在 24 孔板的每个孔中,将大约 400,000 个细胞接种在 300 μL 的“Organo + FBS”中,并向每个孔中添加生长因子:N2 5 μL/孔、G5 5 μL/孔和 B27 10 μL/孔。将 24 孔板置于 37 °C 和 5% CO2 的培养箱中,使细胞粘附。24 小时后,将培养基更换为具有上述生长因子的“神经胶质细胞培养基”(表 1),并每 48 小时更换一次(图 2)。 2. 免疫荧光细胞学 将肠道神经胶质细胞从原代培养物 (P0)(步骤 2.1.14)培养至 70-80% 汇合并传代一次 (P1)。 在应用 0.1% PBS 叠氮化物之前,使用 4% 多聚甲醛将原代培养 (P0) 细胞固定在孔中 5 分钟。 制备由 PBS 叠氮化物、4% 驴血清和 0.5% Triton-X 组成的饱和溶液。向孔中加入 300 μL 饱和溶液,以在室温下透化细胞 2 小时。 在饱和溶液中以 1:1,000 稀释度加入神经胶质标志物神经胶质纤维酸性蛋白 (GFAP) 的一抗和成纤维细胞标志物 α 平滑肌肌动蛋白的一抗,以便在 4 °C 下孵育过夜。 用 PBS 洗涤 3 次,然后在饱和溶液中以 1:500 稀释度加入驴抗兔 IgG Alexa Fluor 594 和山羊抗小鼠 IgG Alexa Flour 488 的二抗 2-3 小时。 在 PBS 中以 1:1,000 的稀释度用 4’,6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) 对细胞核染色 5 分钟。 用 PBS 洗涤 3 次后,将细胞储存在 0.1% PBS 叠氮化物中。 3. 粘膜下马肠道神经胶质原代培养 IL-1β 暴露 当来自第一次传代 (P1) 的细胞达到 70-80% 汇合时,进行 IL-1β 暴露实验。将孔暴露于 0 ng、10 ng 和 25 ng 的 IL-1β 中 24 小时。24小时后,将每个孔中的培养基储存在-80°C下。 4. 用于生产肠上皮细胞单层的马类器官培养 注意:根据 Stewart 等人于 2018 年发布的方案,已冷冻库的马肠隐窝和芽被扩展用于 2D 类肠研究10。 每个 transwell 插入片段使用大约 700-1,000 个芽/隐窝片段(解离成单个细胞时为 40,000-50,000 个细胞)。在添加肠上皮细胞之前,用 42 μL 的 0.05% Matrigel 包被 transwell 插入物。通过在 37 °C 下孵育 1 小时,将 Matrigel 固定在插入物上。吸出多余的培养基,让 transwell 在没有覆盖的情况下干燥 30 分钟。向每个 transwell 插入物中加入 200 μL DMEM-F12 培养基,并将板储存在 37 °C 直至使用。 用 PBS 清洗含有类器官的 Matrigel 肉饼,然后在冰上将它们暴露于 500 μL 的 Cell Recovery 中。反复移液,以确保将细胞完全收集到 15 mL 试管中。 将试管在 4 °C 下以 300 × g 离心 5 分钟,去除上清液,并将细胞沉淀悬浮在目标体积的肠上皮干细胞 (IESC) 培养基中。通过将所需数量的单层数乘以 200 μL 培养基来计算目标体积。(表 1)。 在 IESC 培养基中预涂 1 mL 注射器,并通过 16 G 针头吸出细胞悬液。用 28 G 针替换 16 G 针,并通过它弹出细胞悬液以促进类器官分离。 将 200 μL 所得细胞悬液放入包被的 transwell 的顶端,并将 500 μL IESC 以及先前描述的生长因子置于 transwell 插入物10 的基底侧。每 24-48 小时更换一次培养基和生长因子,直到达到汇合。将汇合定义为对应于 1,000 ohmsxcm 2,11 的 TEER 的单元密度。有关测量,请参阅步骤 5.1。 5. 暴露于炎性细胞因子和马肠胶质细胞产物后的马肠上皮细胞单层通透性 使用双电极 TEER 测量室量化单层的 TEER,并在每个 transwell 通透膜上建立碱基读数。在进行测量之前,确保 IESC 培养基和 transwell 有 15 分钟的时间达到室温。用 1.5 mL 的 IESC 培养基填充培养杯,并确保 transwell 插入物中正好存在 200 μL 的培养基,以便在测量时流体管路匹配。 将 transwell 插入物的基底外侧暴露于每孔 25 ng IL-1β、10 ng 和 25 ng 白细胞介素 6 (IL-6) 的炎性细胞因子或暴露于 10 ng 或 25 ng IL-1β 的培养物的神经胶质产物中。将对照 transwell 插入物的基底外侧暴露于神经胶质细胞培养基和来自未暴露于 IL-1β 的培养物的神经胶质细胞培养基中。 将每个 transwell 放入培养杯中,以 10-15 分钟的间隔测量 TEER 45 分钟。 6. 统计 计算每个 transwell 的 TEER 在以下时间点的倍数变化:0、10、20、30 和 45 分钟。 利用所选软件(参见 材料表),使用未配对的单尾 t 检验比较 TEER 降低与基底外侧暴露于 IL-1β (25 ng)、IL-6(10 ng、25 ng 和 100 ng)和神经胶质细胞培养基(暴露于 0 ng IL-1β、10 ng IL-1β 和 25 ng IL-1β)之间的相关性以对照培养基。

Representative Results

通过进一步的酶和机械消化,将马空肠显微解剖到粘膜下层(图 1),可以产生马肠道神经胶质细胞的活细胞培养物。这些细胞表现出多形性,梭形细胞占主导地位,与其他物种的肠神经胶质细胞一致(图 2A)。培养物对选择性神经胶质标志物神经胶质纤维酸性蛋白 (GFAP) 呈阳性,成纤维细胞污染低(α SMA, …

Discussion

本研究的目的是开发一种可重复的马粘膜下肠道胶质细胞原代培养方法,并证明其在肠绞痛时模拟上皮-胶质细胞相互作用的应用。肠道胶质细胞分离和培养在马中是新颖的,已被证明有助于了解猪和啮齿动物模型以及人类的肠道疾病途径 6,7,13,14。研究这种细胞群可能很重要?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

作者要感谢莫里斯动物基金会对该项目的资助。

Materials

1 M HEPES buffer Gibco 15630-080
10 mM HEPES Life Technologies 15630-106
2 mM GlutaMAX Life Technologies 25050-061
4’6-Diaminidino-2-Phenylindol Invitrogen D3571
Advanced DMEM/F12 Life Technologies 12634-010
Alpha smooth muscle actin antibody Abcam 7817
Amphotericin B Sigma AA9529 4.4 g/mL stock aliquots, final concentration 1.1 µg/mL
Anti-Antimicotic 1x Gibco 15240-096
B27 Gibco 12587010
Bovine Serum Albumin Sigma AA3311
BSA 50 mg/mL stock solution Sigma A3311
CaCL2 ACROS Organiics 206791000 Component of Equine Ringer ‘s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2.
Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
Collagenase Sigma 9891
DMEM-F12 media Thermo Fisher 11320033
Donkey anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 Invitrogen 21207
EVOM EndOhm dual electrode TEER-measuring chamber World Precision Instruments EVM-EL-03-01
EVOM Manual for TEER Measurement World Precision Instruments EVM-MT-03-01
G5 Gibco 17503012
Gentamicin solution Sigma G1272 Final concentration 20 µg/mL
GFAP antibody Abcam 4674
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488 Invitrogen 28175
IL-1β ELISA Thermo Fisher ESIL1B
KCl Thermo Fisher P330-500 Component of Equine Ringer’s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2.
Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
L-glutamine solution Corning 25-00-Cl
Matrigel BD Bioscience 354277
MgCl2 Thermo Fisher M33-500 Component of Equine Ringer’s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2.
Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
N2 Gibco 17502048
Na2HPO4 Thermo Fisher BP332-1 Component of Equine Ringer’s Stock 2: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2.
Combine with Equine Ringer’s Stock 1 to make complete “Ringer’s Solution”.
NaCl Thermo Fisher S271-10 Component of Equine Ringer’s Stock 1: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2.
Combine with Equine Ringer’s Stock 2 to make complete “Ringer’s Solution”.
NaH2PO4 Thermo Fisher BP329-500 Component of Equine Ringer’s Stock 2: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2.
Combine with Equine Ringer’s Stock 1 to make complete “Ringer’s Solution”.
NaHCO3 Thermo Fisher S637-212 Component of Equine Ringer’s Stock 2: combine with other ingredients, then add 100 mL of this stock to a graduated cylinder and dilute to 1L with deionized water. Adjust pH to 7.4 with 5% CO2.
Combine with Equine Ringer’s Stock 1 to make complete “Ringer’s Solution”.
Pen/Strep solution Gemini 400-109
Poly-L-lysine Sigma P2636 0.5 mg/mL in 1x borate buffer
Prism software GraphPad
Protease Sigma P4630
Sodium bicarbonate solution Sigma S8761 7.5% stock solution

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Hellstrom, E., McKinney-Aguirre, C., Gonzalez, L., Ziegler, A., Blikslager, A. Equine Enteric Glial Culture and Application to the Study of a Neural Inflammatory Mechanism in Equine Colic. J. Vis. Exp. (212), e67244, doi:10.3791/67244 (2024).

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