Summary

在离体模型中全面表征组织矿化

Published: September 27, 2024
doi:

Summary

拟议的协议需要一种全球方法,使用多模态分析在骨再生的背景下评估骨形成。它旨在提供有关新骨形成的定性和定量信息,提高基础和临床前研究的严谨性和有效性。

Abstract

鉴于目前可用于分析的多种方式,在骨再生的背景下对组织矿化进行广泛的表征是一项重大挑战。在这里,我们提出了一种使用相关的大型动物 骨离体外植 体全面评估新骨形成的工作流程。在外植的绵羊股骨头中产生骨缺损(直径 = 3.75 毫米;深度 = 5.0 毫米),并注射载有促成骨生长因子(骨形态发生蛋白 2 – BMP2)的大孔骨替代物。随后,外植体在培养物中维持 28 天,允许细胞定植和随后的骨形成。为了评估新矿化组织的质量和结构,建立了以下连续的方法:(i) 使用显微 CT 对整个外植体进行表征和高分辨率 3D 图像,然后进行深度学习图像分析以增强对矿化组织的区分;(ii) 纳米压痕以确定新形成组织的机械性能;(iii) 组织学检查,例如苏木精/伊红/藏红花 (HES)、Goldner 三色和 Movat 五色,以提供矿化组织的定性评估,特别是关于类骨屏障的可视化和骨细胞的存在;(iv) 背向散射扫描电子显微镜 (SEM) 映射与内部参考,以量化矿化程度,并提供对表面形态、矿物成分和骨骼-生物材料界面的详细见解;(v) 拉曼光谱,用于表征矿化基质的分子组成,并通过检测肽键来深入了解 BMP2 在胶结中的持久性。这种多模式分析将提供对新形成的骨骼的有效评估,并对矿化组织进行全面的定性和定量分析。通过这些协议的标准化,我们的目标是促进研究间比较并提高研究结果的有效性和可靠性。

Introduction

骨缺损,无论是由创伤、肿瘤切除、先天性异常还是感染引起的,都是再生医学面临的主要挑战。这些改变损害了骨骼系统的结构完整性,导致不适、功能障碍和患者生活质量的降低。

为了克服这些挑战,出现了创新的骨修复策略,重点是增强成骨和骨组织再生。这些方法包括使用植入式、注射式或 3D 打印的骨替代物,这些替代物可以是天然来源(例如,生物来源的大分子、动物来源的羟基磷灰石)或合成来源(例如,生物玻璃、磷酸钙)1。为了增强其引导和刺激骨再生的低固有能力,骨替代品可以加载成骨诱导因子,例如骨形态发生蛋白 (BMP),以促进祖细胞的成骨分化并增强骨形成2

骨骼形成基于胶原蛋白基质的初始形成,然后被羟基磷灰石晶体矿化,从而加强骨骼结构3。这个过程赋予骨骼特定的刚度和强度。矿化组织的质量受其微观结构属性和矿化程度的复杂控制4。这种品质在骨骼愈合和再生骨骼的功能中起着关键作用5。然而,由于多变量研究的固有可变性,表征骨矿化仍然是一项具有挑战性的任务 6,7,8

此外,通常在 体外对骨移植替代品的生物相容性、细胞相容性和分化潜力进行初步评估。然而,方法学差异阻碍了结局的无缝比较。此外,这些 体外 研究并未完全捕捉细胞群(包括骨髓细胞)之间的多细胞相互作用和复杂对话,这对调节骨再生过程至关重要9。这种缺乏骨微环境的准确表示可能会影响后续临床前研究的准确性10

尽管体内评估提供了更准确的生理环境表示,但它们受到道德、后勤和财务考虑的限制。因此,离体评估作为体外体内研究之间的接口起着关键作用,是继续对活体受试者进行实验之前的必要中间步骤 11,12,13。

在这种情况下,需要实施全面的表征方法来评估再生骨组织的质量,并在进入临床前模型之前确保策略的相关性。因此,我们提出了一种基于使用绵羊膝关节组织对外植体模型进行分析的方案。这种创新方法包括将负载 BMP2 的水泥植入外植体中,并在培养 28 天后对组织矿化进行详细分析。

本研究中采用的技术方法是多种多样且互补的,共同为评估再生骨组织的质量提供了一种全面的方法(图 1)。高分辨率显微 CT 成像能够对骨骼结构进行详细的 3D 可视化,为新形成组织的矿物质密度、形态和完整性提供有价值的见解。该技术对于评估骨再生的功效和监测矿化随时间的进展至关重要。纳米压痕是确定组织机械性能(例如其硬度和强度)的精确方法。通过测量材料对纳米尺度上施加的力的响应,该方法能够评估矿化组织的坚固性和质量。使用苏木精/伊红/藏红花 (HES)、Goldner 三色和 Movat 五色等常见染色的组织学检查为组织结构和组成提供了宝贵的见解。这些染色允许区分各种组织成分,包括细胞、细胞外基质和矿物质沉积物,从而能够对骨再生过程进行全面的定性评估。背向散射扫描电子显微镜 (SEM) 映射提供了样品表面的高分辨率可视化,可以详细分析骨基质的矿化程度,以及植入材料和宿主组织之间的界面。最后,拉曼光谱提供有关组织分子组成的信息,特别是通过鉴定蛋白质、脂质和矿物质等特定成分。这种方法能够表征矿化基质并检测生长因子,例如 BMP2,从而提供有关促成骨刺激在再生培养基中持久性的重要信息。

我们的研究采用多学科方法,整合各种分析技术,旨在对再生骨组织的质量进行彻底和全面的评估,从而为评估骨移植替代品及其潜在的临床应用提供坚实的基础。

Protocol

这项研究已获得伦理和动物福利委员会以及法国国家兽医和食品管理局的批准,编号为 G44171。 1. 骨软骨外植体的制备和培养 在无菌环境中从新鲜安乐死的动物中收获羊关节标本。将绵羊置于仰卧位,剃掉左后肢。用酒精对膝关节周围进行消毒。使用外侧髌旁关节切开术暴露前交叉韧带和后交叉韧带,然后进行髌骨脱位以暴露股滑车。组织采集后,使用骨软骨自体移植系统在外侧髁上创建一个直径为 4.75 毫米的缺损。 使用骨锤,创建一个 10 毫米深的缺损,并从髁突中取出外植体。随后,使用骨软骨自体移植系统进行直径为 8 mm 的第二个缺损,以第一个缺损为中心。这产生了尺寸为 8 mm x 10 mm 的骨软骨外植体,其中包含 4.75 mm x 10.0 mm 的中心缺损。 如果出于物流原因需要,将外植体在补充有 1% 青霉素 – 链霉素的 Hank 平衡盐溶液 (hBSS) 中运输,并在 4 °C 下储存。 用磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 冲洗外植体 3 次,然后用补充有 40 μg/mL BMP2 的磷酸钙水泥注入 4.75 mm x 10.0 mm 缺损。如下所述准备水泥。通过在 1364 °C 下对极饱和磷酸三钙棒(120 MPa 等静压)进行热处理至少 12 小时,然后空气淬火14 小时,生产 α-磷酸三钙 (α-TCP)。 用行星磨球以 500 rpm 的速度在无水乙醇中研磨 α-TCP 棒 2 次,持续 5 分钟,以产生 13.1 ± 1.7 μm 的细粉末(使用激光衍射测量,如前所述14)。 通过在 180 °C 下干热 45 分钟来消毒 α-TCP 粉末。通过将 α-TCP 粉末与 2.5% (w/v) Na2HPO4 0.22 μm 过滤溶液(液体/粉末比为 0.35)混合 1 分钟来制备磷酸钙水泥。 使用 3 G 针头注射前,将水泥膏装入 18 mL 注射器中。 在室温 (RT) 下 10 分钟后,将外植体转移到 25 cm² 培养瓶中,轻轻加入 10 mL 完全培养基,该培养基由 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (DMEM) 高葡萄糖组成,补充有 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素。 将外植体在 37 °C 和 5% CO2 的培养箱中保存长达 28 天,并在层流罩下每 2 天更换一次完整培养基。 用 PBS 冲洗外植体 3 次。将它们转移到 50 mL 试管中,加入 20 mL 4% 多聚甲醛 (PFA),并在 4 °C 下保存 3 天。然后,用 PBS 冲洗外植体并将其储存在 70% 乙醇中,然后再进行后续分析。 2. 显微 CT 分析 利用显微 CT X 射线进行显微断层扫描分析。以 10.7 μm 分辨率采集 X 射线投影,曝光时间为 1200 ms,使用 1 mm 铝制滤光片(80 kV 和 125 μA)。每旋转 0.45° 增量平均 3 张图像,以提高信噪比。 使用参考扫描进行 X/Y 对齐后,使用制造商的重建软件重建三维 (3D) 图像,参数如下 – 平滑:0,环形伪影:3,光束硬化:35%。使用图像处理软件清理图像堆栈,并使用二维 (2D) 和 3D 可视化工具进行观察。 3. 深度学习图像分析 使用专用的专用软件进行图像分割。使用集成的分割向导训练用于骨骼和骨水泥区分的深度学习模型。 从重建的显微 CT 图像中选择一个包含骨骼、骨水泥和背景的代表性区域(即框架)。使用软件提供的简单工具(例如阈值)或强大的工具(例如传播)手动分割第一帧。 在 Model (模型) 选项卡中生成深度学习模型,然后在下拉菜单中选择 3D-Unet Routine(3D-Unet 例程 )。通过右键单击生成的模型,将要分析的图像与 adequation 定义其实验参数;这里:深度为 5,补丁大小 32 x 32,Adadetla 算法,步幅比为 0.25,数据增强 x10。 使用分段帧来训练深度学习例程(单击 Train 按钮),该例程被认为与其快速准确的图像分割功能相关 3,15。训练完成后,定义第二个工作区(帧)并使用 predict 函数自动分段。如果需要,请应用手动校正以生成更准确的训练数据。再次训练例程。重复该过程,直到获得满意的结果;随着训练帧数量的增加,数据增强的数量逐渐减少。注意:模型训练期间提供的 DICE 指数指示模型的准确性(与输入信息相比),但还不够。应由 3 名经验丰富的独立研究人员验证自动分割的数据来确认模型的相关性。 通过单击 Export 按钮发布模型,并通过单击 Segment > Exported Model > Segment Full Dataset 将其应用于整个 micro -CT 数据集。 4. 嵌入 将骨外植体放入含有 25 mL 脱水溶液(由 70% 丙酮和 30% 二甲苯组成的 40 mL 玻璃瓶中)中,使骨外植体脱水。将玻璃瓶放在旋转轮上,在 RT 下放置 1 小时。重复此步骤 3 次。 用 25 mL 二甲苯替换脱水溶液,并将玻璃瓶放在旋转轮上,在 RT 下放置 1 小时。 用 25 mL 富含 10% 过氧化苯甲酰 (BPO) 和 10% 邻苯二甲酸二丁酯 (DBP) 的富含甲基丙烯酸甲酯 (MMA) 的二甲苯溶液代替二甲苯溶液。将其放在旋转轮上,在 RT 下 1 小时。重复此步骤 2 次。 用 25 mL 富含 10% BPO、10% DBP 和 450 μL N,N 二甲基苯胺(以 1:20 的比例稀释于胰 2-醇)的 MMA 替换 MMA 溶液。将玻璃瓶置于-20°C过夜。溶液变黄。 将外植体放入中等大小的包埋模具中,然后将 MMA-BPO-DBP-N、N 苯胺倒入模具中。将模具放入塑料盒中,用氮气流通风 5 分钟。密封盒并将其在 4 °C 下放置 48 小时以进行 MMA 聚合和硬化。 从模具中取出含有外植体的树脂,并将其保持在 4 °C 直至加工以进行后续分析。 5. 扫描电子显微镜 (SEM) – 定量背散射电子成像 (qBEI) 用金刚石锯沿其长轴切割包含外植体的 pMMA 块。保留块的前半部分以进行组织学分析。进一步切割另一半以生成 1.5 毫米厚的部分。以 3000 rpm 的速度以 3 mm/min 的速度进行切割。 用碳化硅纸研磨截面,碳化硅纸的升序数字对应于较小的晶粒尺寸:SiC 320 研磨 10 秒,SiC 1000 研磨 15 秒,SiC 2000 研磨 30 秒,SiC 4000 研磨 30 秒。 用金刚石浆和特定的衣服抛光切片:用 3 μm Mol B3 金刚石溶液抛光布 1 分钟,用 1 μm Nap B1 金刚石溶液抛光羊毛布 1 分钟。 用双蒸水冲洗切片,并用棉签清除钻石颗粒。在氮气下干燥该部分。 对厚截面(10 nm 碳膜厚度)进行碳涂层,并将其安装在涂有银漆的铝短管上。在截面顶部和短线之间制作一个银色油漆桥,以允许电子电荷排放到地面。 将存根放在 SEM 载物台上。在样品旁边,将一个由带有碳、铝和硅标准的法拉第杯组成的对照存根插入 SEM 室。这将用于校准电子束并将灰度水平转换为 Ca 的百分比。关闭 SEM 室并抽真空。 打开电子束并调整 SEM 参数以在背散射电子模式下运行。在反向散射图像上,碳标准品的灰度级别为 25,铝标准品为 225,硅标准品为 253。作为指示,在使用的系统上,SEM 参数为加速电压 20 keV,使用法拉第杯测量的探针电流:250 pA,工作距离:15 mm,孔径:30 μm,图像分辨率:1024 x 768 像素,真空度:< 4.10-4 Pa,停留时间为 100 μs/像素,亮度 ~38 和对比度 ~72。 当 SEM 与标准品校准时,在背散射电子模式下获取样品的图像。 使用样品的背散射电子图像将灰度水平转换为钙含量,如 Roschger 等人 16 所述。使用任何图像分析软件执行此操作。 绘制钙含量的分布。钙含量分布呈高斯分布。计算了三个感兴趣的主要参数:Ca平均值,作为图像上的平均钙含量,Ca峰 作为图像上遇到的最频繁的钙浓度,Ca宽度 作为钙含量分布的一半最大值的全宽。注意:通过连续 5 天(每天采集一次)对同一感兴趣区域进行成像来研究 qBEi 的可重复性。这意味着电子束在会话之间打开和关闭。Ca平均值、Ca峰和 Cawidth 的误差百分比估计分别为 0.5% 、 0.7% 和 1.2%。钙含量也通过能量色散 X 射线分析 (EDS) 进行研究。通过 EDS 估计的 Ca平均值 和钙含量之间建立了非常好的线性关系,R² 值为 0.99,类似于 Roschger 等人之前获得的数据17。 6. 组织学 对于每个样品,使用带有钨刀片 18,19 的硬组织切片机切割 7 μm 切片。使用自动染色系统用 Goldner 三色、HES 和 MOVAT 染色剂对切片进行染色。 对于脱质体,将样品连续浸泡在丙酮中 5 分钟,然后重复 2 次。用蒸馏水冲洗样品 5 分钟,然后重复 2 次。 如下所述执行 Goldner Trichrome 着色。将样品置于 Weigert 苏木精铁中 20 分钟。用自来水清洗。将样品浸入 0.5% 酸性酒精中 30 秒-1 分钟。用自来水清洗 20 分钟。 将样品置于丽春红/品红酸/偶氮菌素溶液中 5 分钟。浸入 1% 乙酸中 1 分钟。 用磷钼酸/Orange G 溶液染色 20 分钟。浸入 1% 乙酸中 1 分钟。 在室温下用固绿溶液染色 15 分钟或在 60 °C 下染色 8 分钟。 用自来水彻底冲洗;重复 3 次。 如下所述执行 Movat Pentachrome 着色。阿尔新蓝染色:将样品浸入阿尔新蓝溶液中 30 分钟。用自来水冲洗样品 5 分钟。将样品置于碱性乙醇中 60 分钟。用自来水冲洗样品 10 分钟。用蒸馏水进行最后一次冲洗。 Weigert 苏木精染色:将样品置于 Weigert 的苏木精铁中 20-30 分钟。用自来水冲洗样品 15 分钟。再次用蒸馏水冲洗。 用 Crocein Brilliant/Fuchsine acid 染色:将样品浸入 Crocein Brilliant/Acid Fuchsin 溶液中 10 分钟。用 0.5% 乙酸冲洗。将样品浸入 5% 磷钨酸溶液中 20 分钟。用 0.5% 乙酸冲洗 2 分钟。用 100% 乙醇连续冲洗 3 次,每次持续 5 分钟。 用 Safran du Gatinais 染色:将样品置于 Safran du Gatinais 中 15 分钟。用自来水进行最后一次冲洗。 如下所述执行 HES 着色。用 Weigert 苏木精染色:将样品浸入 Weigert 苏木精中 30 分钟。用自来水冲洗 2 分钟。 脱色:将样品浸入盐酸酒精中 10 秒。用自来水冲洗 2 分钟。 中和:将样品浸入碳酸锂溶液中 1 分钟。用自来水冲洗 2 分钟。用蒸馏水进行最后冲洗 1 分钟。 用 Eosin-Erythrosine 染色:将样品置于 Eosin-Erythrosine 溶液中 3 分钟。用自来水冲洗 10 秒。 脱水:将样品浸入 95% 酒精中 15 秒。转移到 100% 酒精中 15 秒。重复浸泡在 100% 酒精中 30 秒。 用酒精番红最终染色:将样品浸入酒精番红中 10 分钟。用自来水进行最后一次冲洗。 如下所述执行幻灯片安装。用 95% 乙醇冲洗样品,然后用 100% 乙醇冲洗样品,然后用甲基环己烷冲洗,每个步骤重复 3 次。 使用安装套件安装样品并添加盖玻片。使用数字玻片扫描仪扫描图像。 7. 拉曼显微光谱 使用与 SEM 相同的拉曼分析部分。按照步骤 5.2 – 5.3 中的说明对部分进行短暂研磨和抛光,以去除为 SEM 添加的薄碳层,该薄碳层会损害样品的散热。 将切片放在拉曼微型光谱仪的载物台上。校准波数以确保准确性并在测量前对准激光器。由于这些程序特定于每种仪器,因此本文不会对其进行介绍。 在组织中找到需要分析的感兴趣区域。将要分析的区域放置在视频工具的中心,并使用以下参数收集拉曼光谱:785 nm 激光,使用 30 mW,积分时间:20 秒重复 3 次,光谱范围:350-1800 cm-1,光栅 1200 线/毫米。 收集 10 张具有相同拉曼设置的包埋树脂光谱,并对其进行平均。使用此选项可减去步骤 7.6 中的填料贡献。 按如下方式对光谱进行预处理,以去除荧光、噪声和树脂的贡献:使用五阶多项式拟合进行基线校正,使用 4 次的 Savitzky-Golay 滤波器,窗口大小介于 17 和 21 之间,使用树脂的 ~812 cm-1 峰进行数字树脂减法。这种预处理可以使用专为数据分析和可视化而设计的不同软件来执行。 进一步分析预处理后的频谱,通过将目标振动的峰值强度与参考振动的峰值强度进行配给来提取有价值的参数。例如,对于骨骼分析,请使用以下参数进行计算。矿物与基质比率:将 v1PO4 振动在 ~960 cm-1 处的峰值强度除以酰胺 I (~1668 cm-1)、酰胺 III (~1250 cm-1)、CH2 摇摆 (~1450 cm-1) 的峰值强度或脯氨酸 (~854 cm-1) 和羟脯氨酸 (Hyp, ~872 cm-1) 振动模式的总和。位于 ~430 cm-1 的 v2PO4 或位于 ~600 cm-1 的 v4PO4 也可以与 Amide III vibration20 一起使用并配比。这些参数代表骨基质有机相的矿化程度。 碳酸盐/磷酸盐:将位于 ~1070 cm-1 的 v1CO3 的峰强度除以 v1PO4。这表示磷灰石晶格中 B 型碳酸盐取代的量。Hyp/Pro 代表羟脯氨酸含量,~1375 cm-1/酰胺 III 代表蛋白多糖含量,~1150 cm-1/CH2-wag 和 ~1495 cm-1/CH2-wag,代表晚期糖基化终产物羧甲基伊氨酸和戊糖苷的量,1670 cm-1/1690 cm-1 和 1670 cm-1/1640 cm-1分别代表胶原蛋白的无序二级结构,也称为胶原蛋白成熟度,以及 I 型胶原蛋白中 α-螺旋形式的有序结构。 通过在 5 次连续采集(每天一次采集)中检查相同的感兴趣区域来评估拉曼测量的重现性。对于每个分析参数,方差均低于参数值的 0.2%,具有良好的重现性。该领域已广泛讨论了每个所研究峰的特异性,最近对 Unal21 的综述中进行了概述。 8. 纳米压痕 注意:由于纳米压痕的破坏性,通常在样品分析程序结束时进行。我们拥有的纳米压痕系统配备了金字塔形的 Berkovitch 金刚石压头。然而,存在几种压头形状,文献中尚未确定骨骼或生物材料标本的共识。 在纳米压痕测试之前,在 RT 下将嵌入的骨标本在盐水中水合 16 小时。 使用熔融石英校准纳米压痕系统并记录所得的压痕模量。对于熔融石英,使用泊松系数 0.17 时,压痕模量约为 72 GPa。 校准纳米压痕系统后,将用于拉曼分析的样品放入纳米压痕装置的光学系统中,以指出将进行纳米压痕的位置。注意:这种方式因设备而异;我们没有详细说明纳米压痕系统和软件的工作原理,但就应该执行的不同步骤给出了一般性建议。 选择纳米压痕的位置后,将样品移动到压痕装置下方并进行压痕。在 900 nm 的恒定深度下进行纳米压痕,加载/卸载速度为 40 mm/min,加载和卸载之间暂停 15 s。将骨骼组织的 Poisson 系数设置为 0.3。 从纳米压痕曲线中检索不同的参数,并根据 Oliver 和 Pharr 的理论22 计算它们。压痕模量 (EIT) 由压痕尖端的已知特性和折减模量得出,并结合了试样的局部弹性模量。计算缩进为:其中 vs、vi、Ei 和 Er 表示样品的泊松系数,假设骨骼为 0.3,金刚石压头的泊松系数假设为 0.07,金刚石压头的弹性模量(固定为 1140 GPa)和折减模量,计算如下:其中 S 代表卸货段的坡度,Ap 是投影面积,计算公式为: 硬度 (HIT):对应于骨骼对裂纹起生和扩展的抵抗力。换句话说,它是骨骼韧性的指标。将 HIT 计算为: 压痕蠕变率 (CIT):这反映了在恒定载荷下骨骼随时间的变形,表明试样的粘弹性,计算公式为: 最大负荷 (Lm):这对应于穿透指定深度进入矿化骨基质所需的相对负荷。 压痕功 (Wplast):这对应于载荷/卸载变形曲线下的面积。它是为引起塑性变形而耗散的能量的直接反映。注意:由于这种方法的破坏性,纳米压痕的可重复性更难在骨样本上进行评估。尽管如此,我们估计了标准和均匀熔融石英样品的重现性。对于上述所有参数,方差估计值低于 0.26%(在 5 个单独的日期连续测量 5 次),支持非常好的重现性。另一方面,由于骨骼样本的各向异性,更难评估它们的可重复性。

Representative Results

外植体的显微 CT 图像如图 2 所示。使用手动分割无法使用全局阈值以最佳方式将骨头与中央管中存在的骨水泥分开。为了提高对骨小梁和骨水泥的识别,我们建议使用深度学习。深度学习在识别生物材料特性方面非常强大,有助于改善骨骼和骨水泥之间的分离,从而更好地评估骨水泥-骨骼相互作用。为了准确量化在与水泥界面处形成的骨量,并且?…

Discussion

修复骨缺损是再生医学中恢复活动能力、减轻疼痛和改善受影响个体生活质量的主要挑战。与体内研究相比,使用外植体模型在研究骨缺损修复方面具有许多优势。除了伦理考虑外,该模型还允许严格控制实验条件并减少生物变异性,从而促进产生更准确和可重复的结果。此外,与其他动物相比,羊骨的机械和生物学特性与人类骨骼的机械和生物学特性密切相关<su…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

我们要感谢参与标本采集和处理的技术设施,包括 SC3M(SFR Francois Bonamy (UMS 016),南特大学)、SFR ICAT(昂热大学)、BIO3、HiMolA 和 SC4BIO。Inserm UMR_S 1229 RMeS 由法国政府通过 Inserm、南特大学、昂热大学和 Oniris VetAgroBio 机构提供的资助。CL 也非常感谢 HTL Biotechnology。

Materials

0.20 filters VWR  28145-501
18 G needle (1,2×40 mm) Sterican 4665120
3 mL syringe HENKE-JECT 8300005762
37% hydrochloric acid  VWR  1.00317.1000 
Acetic acid (glacial)  Sigma  A6283 
Acetone  VWR  20063-365 
Alcian Blue 8GX VWR  361186
Ammonium hydroxide VWR  318612
Apatitic tricalcium phosphate  Centre for Biomedical and Healthcare Engineering (Mines Saint Etienne, France) TV26U 
Azophloxine Sigma  210633
Benzoyl peroxide Sigma  8.01641.0250
BMP2 Medtronic  InductOs 1.5 mg/mL
Brillant crocein  Aldrich  2107507
CTVox  Bruker
DataViewer  Skyscan
Diamond blade Struers MOD13
Diamond saw Struers Accutom-50
DiaPro Mol B3 diamond solution Struers 40600379
DiaPro Nap B1 diamond solution Struers 40600373
Dibasic sodium phosphate (Na2HPO4) Sigma  102404598
Dibutyl Phtalate Chimie-Plus Laboratoires 28656
DragonFly software  ORS 2022.1.0.1231. 
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) high glucose, GlutaMAX(TM), pyruvate ThermoFisher Scientific 31966-021
Eosine Y- Surgipath  Sigma  1002830105
Erythrosin B Sigma  102141057
Ethanol absolute VWR  20820362
Eukitt  Dutscher 6.00.01.0003.06.01.01
Falcon 50 mL Sarstedt 62.547.254
Ferric chloride hexahydrate (FeCl3, 6H2O)  Merck  1.03943.0250
Fetal Bovine Serum (FBS)  Eurobio CVFSVF00
Fuchsine acid Merck  1.05231.0025 
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Biosera MS01NG100J
Hematoxylin Sigma  86.118.9 
Isostatic press Nova Suisse Pmax 1500 bars
Laser diffraction granulometry  Malvern Mastersizer 3000
Light green Prolabo  28947135
Lithium carbonate Sigma  A13149 
MD-Mol polishing cloth Struers 40500077
Methylcyclohexane VWR  8.06147.1000 
Methylcyclohexane  VWR  8.06147.1000 
Methylcyclohexane  VWR  8.06147.1000 
Methylmethacrylate Sigma  8.00590.2500
Micro-CT, micro-scanner  Bruker Skyscan 1272
Monobasic sodium phosphate (NAH2PO4) Sigma  71496
Mortar Fritsch  Pulverisette 6
N,N, Dimethylanilin Sigma  803060
Nanoindentation station Anton Paar NHT2
ND-Nap polishing cloth Struers 40500080
OATS Osteochondral Autograft Transfer System Set, 4,75 mm Arthrex AR-1981-04S
OATS Osteochondral Autograft Transfer System Set, 8 mm Arthrex AR-1981-08S
Orange G Ral M15
Paraformaldehyde (PFA) Sigma  P6148
Peel-a-way disposable embbedding moulds Polysciences, Inc 18646C-1
Penicillin/Streptomycin (P/S) ThermoFisher Scientific 15140122
Phosphate Buffered Saline (PBS) ThermoFisher Scientific 10010023
Phosphomolybdic acid  Sigma  221856-100 g
Phosphotungstic acid Aldrich  12863-5 
Polishing machine Sturers Dap V
Poupinel MEMMERT TV26U 
Raman microspectrometer Renishaw InVia Qontor
Safran du Gâtinais  Labonord  11507737
Scanning electron microscope Carl Zeiss Evo LS 10
SEM Zeiss Carl Zeiss Evo LS10
SiC foils/Grinding papers Struers 40400008 (#320), 40400011 (#1000), 40400122 (#2000), 40400182 (#4000)
Silver paint Electron microscopy sciences 12686-15
Standard stub with Faraday cup, carbon, aluminium and silicon standards Micro-Analysis Consultants Ltd 8602
T25 flask Corning 430639
Xylene VWR  28975.325
Xylidine Ponceau Aldrich  19.976-1 

References

  1. Feroz, S., Cathro, P., Ivanovski, S., Muhammad, N. Biomimetic bone grafts and substitutes: A review of recent advancements and applications. Biomed Eng Adv. 6, 100107 (2023).
  2. Tsuji, K., et al. BMP2 activity, although dispensable for bone formation, is required for the initiation of fracture healing. Nat Genet. 38 (12), 1424-1429 (2006).
  3. Hadjidakis, D. J., Androulakis, I. I. Boneremodeling. Ann N Y Acad Sci. 1092, 385-396 (2006).
  4. Boivin, G., Meunier, P. J. The degree of mineralization of bone tissue measured by computerized quantitative contact microradiography. Calcified Tiss Int. 70 (6), 503-511 (2002).
  5. Boivin, G., et al. Influence of remodeling on the mineralization of bone tissue. Osteoporo Int. 20 (6), 1023-1026 (2009).
  6. Zanghellini, B., et al. Multimodal analysis and comparison of stoichiometric and structural characteristics of parosteal and conventional osteosarcoma with massive sclerosis in human bone. J Str Biol. 216 (3), 108106 (2024).
  7. Trento, G., et al. formation around two titanium implant surfaces placed in bone defects with and without a bone substitute material: A histological, histomorphometric, and micro-computed tomography evaluation. Clin Implant Dent Relat Res. 22 (2), 177-185 (2020).
  8. Palmquist, A. A multiscale analytical approach to evaluate osseointegration. J Mater Sci Mater Med. 29 (5), 60 (2018).
  9. Budán, F., et al. Novel radiomics evaluation of bone formation utilizing multimodal (SPECT/X-ray CT) in vivo imaging. PLoS ONE. 13 (9), e0204423 (2018).
  10. Hulsart-Billström, G., et al. A surprisingly poor correlation between in vitro and in vivo testing of biomaterials for bone regeneration: results of a multicentre analysis. Eur Cells Mater. 31, 312-322 (2016).
  11. Cramer, E. E. A., Ito, K., Hofmann, S. Ex vivo bone models and their potential in preclinical evaluation. Curr Osteoporo Rep. 19 (1), 75-87 (2021).
  12. Chan, M. E., et al. A trabecular bone explant model of osteocyte-osteoblast co-culture for bone mechanobiology. Cell Mol Bioeng. 2 (3), 405-415 (2009).
  13. Doke, S. K., Dhawale, S. C. Alternatives to animal testing: A review. Saudi Pharma J. 23 (3), 223-229 (2015).
  14. Moussi, H., et al. New formulation of injectable and degradable calcium phosphate/silanized hyaluronic acid composite foam: Investigation in a rabbit model of long bone defect. SSRN. , (2024).
  15. Paré, A., et al. Standardized and axially vascularized calcium phosphate-based implants for segmental mandibular defects: A promising proof of concept. Acta Biomater. 154, 626-640 (2022).
  16. Roschger, P., Fratzl, P., Eschberger, J., Klaushofer, K. Validation of quantitative backscattered electron imaging for the measurement of mineral density distribution in human bone biopsies. Bone. 23 (4), 319-326 (1998).
  17. Roschger, P., Plenk, H., Klaushofer, K., Eschberger, J. A new scanning electron microscopy approach to the quantification of bone mineral distribution: backscattered electron image grey-levels correlated to calcium K alpha-line intensities. Scanning Micro. 9 (1), 75-86 (1995).
  18. Porter, A., et al. Quick and inexpensive paraffin-embedding method for dynamic bone formation analyses. Sci Rep. 7, 42505 (2017).
  19. Goldschlager, T., Abdelkader, A., Kerr, J., Boundy, I., Jenkin, G. Undecalcified bone preparation for histology, histomorphometry and fluorochrome analysis. J Vis Exp. (35), e1707 (2010).
  20. Kazanci, M., Roschger, P., Paschalis, E. P., Klaushofer, K., Fratzl, P. Bone osteonal tissues by Raman spectral mapping: Orientation-composition. J Str Biol. 156 (3), 489-496 (2006).
  21. Unal, M., Ahmed, R., Mahadevan-Jansen, A., Nyman, J. S. Compositional assessment of bone by Raman spectroscopy. Analyst. 146 (24), 7464-7490 (2021).
  22. Oliver, W. C., Pharr, G. M. An improved technique for determining hardness and elastic modulus using load and displacement sensing indentation experiments. J Mater Res. 7 (6), 1564-1583 (1992).
  23. Proffen, B. L., McElfresh, M., Fleming, B. C., Murray, M. M. A comparative anatomical study of the human knee and six animal species. Knee. 19 (4), 493-499 (2012).
  24. Allen, M. J., Houlton, J. E. F., Adams, S. B., Rushton, N. The surgical anatomy of the stifle joint in Sheep. Vet Surg. 27 (6), 596-605 (1998).
  25. Kleuskens, M. W. A., van Donkelaar, C. C., Kock, L. M., Janssen, R. P. A., Ito, K. An ex vivo human osteochondral culture model. J Ortho Res. 39 (4), 871-879 (2021).

Play Video

Cite This Article
Lesage, C., Guihard, P., De Fourmestraux, C., Gauthier, O., Weiss, P., Guicheux, J., Mieczkowska, A., Véziers, J., Charbonnier, B., Boutet, M., Mabilleau, G. Comprehensive Characterization of Tissue Mineralization in an Ex Vivo Model. J. Vis. Exp. (211), e67235, doi:10.3791/67235 (2024).

View Video