拟议的协议需要一种全球方法,使用多模态分析在骨再生的背景下评估骨形成。它旨在提供有关新骨形成的定性和定量信息,提高基础和临床前研究的严谨性和有效性。
鉴于目前可用于分析的多种方式,在骨再生的背景下对组织矿化进行广泛的表征是一项重大挑战。在这里,我们提出了一种使用相关的大型动物 骨离体外植 体全面评估新骨形成的工作流程。在外植的绵羊股骨头中产生骨缺损(直径 = 3.75 毫米;深度 = 5.0 毫米),并注射载有促成骨生长因子(骨形态发生蛋白 2 – BMP2)的大孔骨替代物。随后,外植体在培养物中维持 28 天,允许细胞定植和随后的骨形成。为了评估新矿化组织的质量和结构,建立了以下连续的方法:(i) 使用显微 CT 对整个外植体进行表征和高分辨率 3D 图像,然后进行深度学习图像分析以增强对矿化组织的区分;(ii) 纳米压痕以确定新形成组织的机械性能;(iii) 组织学检查,例如苏木精/伊红/藏红花 (HES)、Goldner 三色和 Movat 五色,以提供矿化组织的定性评估,特别是关于类骨屏障的可视化和骨细胞的存在;(iv) 背向散射扫描电子显微镜 (SEM) 映射与内部参考,以量化矿化程度,并提供对表面形态、矿物成分和骨骼-生物材料界面的详细见解;(v) 拉曼光谱,用于表征矿化基质的分子组成,并通过检测肽键来深入了解 BMP2 在胶结中的持久性。这种多模式分析将提供对新形成的骨骼的有效评估,并对矿化组织进行全面的定性和定量分析。通过这些协议的标准化,我们的目标是促进研究间比较并提高研究结果的有效性和可靠性。
骨缺损,无论是由创伤、肿瘤切除、先天性异常还是感染引起的,都是再生医学面临的主要挑战。这些改变损害了骨骼系统的结构完整性,导致不适、功能障碍和患者生活质量的降低。
为了克服这些挑战,出现了创新的骨修复策略,重点是增强成骨和骨组织再生。这些方法包括使用植入式、注射式或 3D 打印的骨替代物,这些替代物可以是天然来源(例如,生物来源的大分子、动物来源的羟基磷灰石)或合成来源(例如,生物玻璃、磷酸钙)1。为了增强其引导和刺激骨再生的低固有能力,骨替代品可以加载成骨诱导因子,例如骨形态发生蛋白 (BMP),以促进祖细胞的成骨分化并增强骨形成2。
骨骼形成基于胶原蛋白基质的初始形成,然后被羟基磷灰石晶体矿化,从而加强骨骼结构3。这个过程赋予骨骼特定的刚度和强度。矿化组织的质量受其微观结构属性和矿化程度的复杂控制4。这种品质在骨骼愈合和再生骨骼的功能中起着关键作用5。然而,由于多变量研究的固有可变性,表征骨矿化仍然是一项具有挑战性的任务 6,7,8。
此外,通常在 体外对骨移植替代品的生物相容性、细胞相容性和分化潜力进行初步评估。然而,方法学差异阻碍了结局的无缝比较。此外,这些 体外 研究并未完全捕捉细胞群(包括骨髓细胞)之间的多细胞相互作用和复杂对话,这对调节骨再生过程至关重要9。这种缺乏骨微环境的准确表示可能会影响后续临床前研究的准确性10。
尽管体内评估提供了更准确的生理环境表示,但它们受到道德、后勤和财务考虑的限制。因此,离体评估作为体外和体内研究之间的接口起着关键作用,是继续对活体受试者进行实验之前的必要中间步骤 11,12,13。
在这种情况下,需要实施全面的表征方法来评估再生骨组织的质量,并在进入临床前模型之前确保策略的相关性。因此,我们提出了一种基于使用绵羊膝关节组织对外植体模型进行分析的方案。这种创新方法包括将负载 BMP2 的水泥植入外植体中,并在培养 28 天后对组织矿化进行详细分析。
本研究中采用的技术方法是多种多样且互补的,共同为评估再生骨组织的质量提供了一种全面的方法(图 1)。高分辨率显微 CT 成像能够对骨骼结构进行详细的 3D 可视化,为新形成组织的矿物质密度、形态和完整性提供有价值的见解。该技术对于评估骨再生的功效和监测矿化随时间的进展至关重要。纳米压痕是确定组织机械性能(例如其硬度和强度)的精确方法。通过测量材料对纳米尺度上施加的力的响应,该方法能够评估矿化组织的坚固性和质量。使用苏木精/伊红/藏红花 (HES)、Goldner 三色和 Movat 五色等常见染色的组织学检查为组织结构和组成提供了宝贵的见解。这些染色允许区分各种组织成分,包括细胞、细胞外基质和矿物质沉积物,从而能够对骨再生过程进行全面的定性评估。背向散射扫描电子显微镜 (SEM) 映射提供了样品表面的高分辨率可视化,可以详细分析骨基质的矿化程度,以及植入材料和宿主组织之间的界面。最后,拉曼光谱提供有关组织分子组成的信息,特别是通过鉴定蛋白质、脂质和矿物质等特定成分。这种方法能够表征矿化基质并检测生长因子,例如 BMP2,从而提供有关促成骨刺激在再生培养基中持久性的重要信息。
我们的研究采用多学科方法,整合各种分析技术,旨在对再生骨组织的质量进行彻底和全面的评估,从而为评估骨移植替代品及其潜在的临床应用提供坚实的基础。
修复骨缺损是再生医学中恢复活动能力、减轻疼痛和改善受影响个体生活质量的主要挑战。与体内研究相比,使用外植体模型在研究骨缺损修复方面具有许多优势。除了伦理考虑外,该模型还允许严格控制实验条件并减少生物变异性,从而促进产生更准确和可重复的结果。此外,与其他动物相比,羊骨的机械和生物学特性与人类骨骼的机械和生物学特性密切相关<su…
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢参与标本采集和处理的技术设施,包括 SC3M(SFR Francois Bonamy (UMS 016),南特大学)、SFR ICAT(昂热大学)、BIO3、HiMolA 和 SC4BIO。Inserm UMR_S 1229 RMeS 由法国政府通过 Inserm、南特大学、昂热大学和 Oniris VetAgroBio 机构提供的资助。CL 也非常感谢 HTL Biotechnology。
0.20 filters | VWR | 28145-501 | |
18 G needle (1,2×40 mm) | Sterican | 4665120 | |
3 mL syringe | HENKE-JECT | 8300005762 | |
37% hydrochloric acid | VWR | 1.00317.1000 | |
Acetic acid (glacial) | Sigma | A6283 | |
Acetone | VWR | 20063-365 | |
Alcian Blue 8GX | VWR | 361186 | |
Ammonium hydroxide | VWR | 318612 | |
Apatitic tricalcium phosphate | Centre for Biomedical and Healthcare Engineering (Mines Saint Etienne, France) | TV26U | |
Azophloxine | Sigma | 210633 | |
Benzoyl peroxide | Sigma | 8.01641.0250 | |
BMP2 | Medtronic | InductOs 1.5 mg/mL | |
Brillant crocein | Aldrich | 2107507 | |
CTVox | Bruker | – | |
DataViewer | Skyscan | – | |
Diamond blade | Struers | MOD13 | |
Diamond saw | Struers | Accutom-50 | |
DiaPro Mol B3 diamond solution | Struers | 40600379 | |
DiaPro Nap B1 diamond solution | Struers | 40600373 | |
Dibasic sodium phosphate (Na2HPO4) | Sigma | 102404598 | |
Dibutyl Phtalate | Chimie-Plus Laboratoires | 28656 | |
DragonFly software | ORS | 2022.1.0.1231. | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) high glucose, GlutaMAX(TM), pyruvate | ThermoFisher Scientific | 31966-021 | |
Eosine Y- Surgipath | Sigma | 1002830105 | |
Erythrosin B | Sigma | 102141057 | |
Ethanol absolute | VWR | 20820362 | |
Eukitt | Dutscher | 6.00.01.0003.06.01.01 | |
Falcon 50 mL | Sarstedt | 62.547.254 | |
Ferric chloride hexahydrate (FeCl3, 6H2O) | Merck | 1.03943.0250 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Eurobio | CVFSVF00 | |
Fuchsine acid | Merck | 1.05231.0025 | |
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Biosera | MS01NG100J | |
Hematoxylin | Sigma | 86.118.9 | |
Isostatic press | Nova Suisse | Pmax 1500 bars | |
Laser diffraction granulometry | Malvern | Mastersizer 3000 | |
Light green | Prolabo | 28947135 | |
Lithium carbonate | Sigma | A13149 | |
MD-Mol polishing cloth | Struers | 40500077 | |
Methylcyclohexane | VWR | 8.06147.1000 | |
Methylcyclohexane | VWR | 8.06147.1000 | |
Methylcyclohexane | VWR | 8.06147.1000 | |
Methylmethacrylate | Sigma | 8.00590.2500 | |
Micro-CT, micro-scanner | Bruker | Skyscan 1272 | |
Monobasic sodium phosphate (NAH2PO4) | Sigma | 71496 | |
Mortar | Fritsch | Pulverisette 6 | |
N,N, Dimethylanilin | Sigma | 803060 | |
Nanoindentation station | Anton Paar | NHT2 | |
ND-Nap polishing cloth | Struers | 40500080 | |
OATS Osteochondral Autograft Transfer System Set, 4,75 mm | Arthrex | AR-1981-04S | |
OATS Osteochondral Autograft Transfer System Set, 8 mm | Arthrex | AR-1981-08S | |
Orange G | Ral | M15 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
Peel-a-way disposable embbedding moulds | Polysciences, Inc | 18646C-1 | |
Penicillin/Streptomycin (P/S) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
Phosphomolybdic acid | Sigma | 221856-100 g | |
Phosphotungstic acid | Aldrich | 12863-5 | |
Polishing machine | Sturers | Dap V | |
Poupinel | MEMMERT | TV26U | |
Raman microspectrometer | Renishaw | InVia Qontor | |
Safran du Gâtinais | Labonord | 11507737 | |
Scanning electron microscope | Carl Zeiss | Evo LS 10 | |
SEM | Zeiss | Carl Zeiss Evo LS10 | |
SiC foils/Grinding papers | Struers | 40400008 (#320), 40400011 (#1000), 40400122 (#2000), 40400182 (#4000) | |
Silver paint | Electron microscopy sciences | 12686-15 | |
Standard stub with Faraday cup, carbon, aluminium and silicon standards | Micro-Analysis Consultants Ltd | 8602 | |
T25 flask | Corning | 430639 | |
Xylene | VWR | 28975.325 | |
Xylidine Ponceau | Aldrich | 19.976-1 |