Trasplante celular de alta resolución en embriones y larvas de pez cebra

El trasplante de células tiene una larga historia como técnica fundamental en la biología del desarrollo. A principios^{del siglo XX}, los enfoques que utilizaban manipulaciones físicas para perturbar el proceso de desarrollo, incluido el trasplante, transformaron la embriología de una ciencia observacional en una experimental ^1,2. En un experimento histórico, Hans Spemann y Hilde Mangold trasplantaron ectópicamente el labio dorsal de blastoporo de un embrión de salamandra al lado opuesto de un embrión huésped, induciendo el tejido cercano a formar un eje corporal secundario³. Este experimento demostró que las células podían inducir a otras células a adoptar ciertos destinos y, posteriormente, el trasplante se desarrolló como un método poderoso para interrogar preguntas críticas en biología del desarrollo con respecto a la competencia y la determinación del destino celular, el linaje celular, la capacidad inductiva, la plasticidad y la potencia de las células madre ^1,4,5.

Los avances científicos más recientes han ampliado el poder del enfoque de trasplante. En 1969, el descubrimiento de Nicole Le Douarin de que la tinción nucleolar podía distinguir las especies de origen en las quimeras de los polluelos de codorniz permitió el seguimiento de las células trasplantadas y su progenie⁶. Este concepto fue posteriormente potenciado por el advenimiento de los marcadores fluorescentes transgénicos y las técnicas avanzadas de imagen⁵, y ha sido aprovechado para rastrear el destino de las células ^6,7, identificar las células madre y su potencia ^8,9 y rastrear los movimientos celulares durante el desarrollo del cerebro¹⁰. Además, el auge de la genética molecular facilitó el trasplante entre huéspedes y donantes de genotipos distintos, lo que permitió una disección precisa de las funciones autónomas y no autónomas de los factores de desarrollo¹¹.

El trasplante también ha hecho contribuciones importantes al estudio de la regeneración, particularmente en organismos con fuertes capacidades regenerativas como las planarias y el ajolote, al dilucidar las identidades celulares y las interacciones que regulan el crecimiento y el patrón de los tejidos en regeneración. Los estudios de trasplante han revelado los principios de la potencia¹², el patrón espacial^13,14, las contribuciones de tejidos específicos^15,16 y el papel de la memoria celular^12,17 en la regeneración.

El pez cebra es un modelo de vertebrado líder para el estudio del desarrollo y la regeneración, incluso en el sistema nervioso, debido a sus programas genéticos conservados, alta manejabilidad genética, fertilización externa, gran tamaño de nidada y claridad óptica 18,19,20. El pez cebra también es muy susceptible al trasplante en las primeras etapas de desarrollo. El enfoque más destacado es el trasplante de células de un embrión donante marcado a un embrión huésped en la etapa de blástula o gástrula para generar animales en mosaico. Las células trasplantadas durante la etapa de blástula se dispersarán y dispersarán a medida que comienza la epibolía, produciendo un mosaico de células y tejidos marcados a lo largo del embrión²¹. Los trasplantes de gástrula permiten seleccionar las células trasplantadas de acuerdo con un mapa de destino aproximado a medida que se forma el escudo y se pueden determinar los ejes A-P y D-V²¹. Los mosaicos resultantes han sido valiosos para determinar si los genes actúan de forma autónoma de las células, probar el compromiso celular y mapear el movimiento de los tejidos y la migración celular a lo largo del desarrollo ^5,11. El pez cebra mosaico se puede generar de varias maneras, incluida la electroporación²², la recombinación²³ y la transgénesis F0²⁴ y la mutagénesis²⁵, pero el trasplante proporciona la mayor manipulabilidad y precisión en el espacio, el tiempo y el número y los tipos de células. El estado actual del trasplante de pez cebra se limita en gran medida a las células progenitoras en etapas tempranas, con algunas excepciones que incluyen el trasplante de neuronas motoras espinales^26,27, células ganglionares de la retina^28,29 y células de la cresta neural en las primeras 10-30 h después de la fertilización (hpf)³⁰, y de células hematopoyéticas y tumorales en peces cebra adultos ^5,31. La expansión de los métodos de trasplante a una amplia gama de edades, etapas de diferenciación y tipos de células mejoraría en gran medida el poder de este enfoque para proporcionar información sobre los procesos de desarrollo y regeneración.

Aquí, demostramos una técnica flexible y robusta para el trasplante de células de alta resolución efectiva en embriones y larvas de pez cebra hasta al menos 7 días después de la fertilización. Los peces transgénicos huéspedes y donantes que expresan proteínas fluorescentes en los tejidos diana pueden utilizarse para extraer células individuales y trasplantarlas con una resolución espacial y temporal casi perfecta. La claridad óptica de los embriones y larvas de pez cebra permite obtener imágenes de las células trasplantadas en vivo a medida que el animal huésped se desarrolla o se regenera. Este enfoque se ha utilizado previamente para examinar cómo la dinámica de señalización espacio-temporal influye en la identidad neuronal y la guía de los axones en el embrión³², y para examinar la lógica por la cual los factores intrínsecos y extrínsecos promueven la guía de los axones durante la regeneración en las larvas^{de peces 33}. Si bien nos centramos aquí en el trasplante de neuronas diferenciadas, nuestro método es ampliamente aplicable tanto a tipos de células indiferenciadas como diferenciadas en muchas etapas y tejidos para abordar cuestiones de desarrollo y regeneración.