Selenoprotein O'ya Substrat Bağlanmasını Araştırmak için Termal Kaydırma Testinin Kullanılması

İnsan proteomunun çoğu zayıf bir şekilde karakterize edilmiştir. Dunham ve Kustatscher ve arkadaşları tarafından tanımlanan “sokak lambası etkisi”, kapsamlı bir şekilde araştırılmış proteinlerin daha fazla dikkat çektiği ve az çalışılmış proteinlerin göz ardı edildiği fenomeni ifade eder ^1,2. Bu etkiye katkıda bulunan faktörler arasında bazı proteinlerin biyolojik önemi ve hastalık ilgisi yer alır. Ayrıca, temel bilgileri sunan önceki araştırmaların yanı sıra fonksiyonel analiz için araçların mevcudiyeti, çok çalışılmış proteinler ^1,2 üzerindeki araştırmaları daha da teşvik eder. Az Çalışılmış Proteinler Girişimi, Yapısal Genomik Konsorsiyumu ve Enzim Fonksiyonu Girişimi gibi projeler, yapısal ve fonksiyonel proteomik ^2,3,4 kullanarak az çalışılmış proteinleri karakterize etmeyi amaçlamaktadır. Az çalışılmış proteinlerin moleküler işlevlerini tanımlamaya yönelik tamamlayıcı bir yaklaşım, regülasyon ve substrat özgüllüğü hakkında değerli bilgiler elde etmek için bu proteinlerin küçük moleküllerle etkileşimlerini incelemektir.

Küçük moleküllerin bağlanması, bir proteinin⁵ termal stabilitesini artırabilir. Ligandın neden olduğu konformasyon stabilizasyonu olarak bilinen bu fenomen, genellikle bir proteinin erime sıcaklığında bir artışa neden olur ve ligand bağlanmasının^{ölçülebilir} bir göstergesini sağlar 6. Bir proteinin termal stabilitesi, Termoflor veya Termal Kayma Testi (TSA) olarak da bilinen Diferansiyel Taramalı Florimetri (DSF) kullanılarak ^{ölçülebilir7,8,9,10}. TSA’da, bir protein numunesi, çevreye duyarlı bir boya⁶ varlığında artan sıcaklıklara tabi tutulur. Protein açıldıkça ve denatüre oldukça, boya proteinin açıkta kalan hidrofobik bölgelerine bağlanır ve floresan yayar. Dışsal floresan boyalar veya çevreye duyarlı boyalar, içsel floresanstan yoksundur ve bunun yerine hedef molekülleri ^9,11,12 ile etkileşime girdiklerinde floresan yanarlar. En yaygın olarak kullanılan boya olan SYPRO Orange, gelişmiş stabilite ve minimum arka plan floresansı ^8,9,12 gibi çeşitli avantajlar sunar. Özellikle, SYPRO Orange, sırasıyla 470 nm ve 570 nm civarında uyarma ve emisyon dalga boyları göz önüne alındığında Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR) sistemleriyle uyumludur. Bu benzersiz özellik, RT-PCR sistemlerinde yaygın olarak kullanılan floresan algılama sistemleriyle uyumlu yüksek verimli, doğru ve hassas ölçümlere olanak tanır⁸.

TSA, potansiyel kofaktörler veya ilaçlarla protein etkileşimlerini araştırmak ve kristalografi için stabilize edici koşulları belirlemek için çok yönlü bir araçtır. Diğer tarama yöntemlerine göre avantajlarından bazıları, göreceli kurulum basitliği ve 96 veya 384 oyuklu plakalar 13,14,15 ile yüksek verimidir. Bu tekniğin geliştirilmesi, ilaç keşif çalışmaları için dönüştürücü olmuş, kolaylık sağlamış ve iyonlar, ligandlar ve ilaçlar gibi çeşitli katkı maddelerinin incelenmesini sağlamıştır ^6,16. Ayrıca, TSA’nın uyarlanabilirliği, bilim adamlarını, tarama tahlillerinin yanı sıra bağlanma afinitelerinin ölçümünü kolaylaştırarak, faydasını genişletmeye teşvik etmiştir^17,18. TSA, kristalleşme için ilgilenilen proteinin stabilizasyonunu destekleyen koşulları belirlemek için yapısal biyoloji çalışmalarında etkili bir araçtır¹⁹. Bu nedenle, esnekliği ve göreceli kolaylığı, TSA’yı proteinleri karakterize etmede bir köşe taşı tekniği olarak konumlandırmıştır. Burada, örnek olarak metallerin ve nükleotidin az çalışılmış psödokinaz olan Selenoprotein O’ya (SelO) bağlanmasını analiz etmek için TSA’yı kullanacağız.

Kinazlar, ilaç keşfinde en çok hedeflenen protein ailelerinden biridir²⁰. İnsan kinazların yaklaşık% 10’unun inaktif olduğu ve kataliz için gerekli olan temel katalitik kalıntılardan yoksun oldukları için psödokinazlar olarak adlandırıldığı tahmin edilmektedir^21,22. Selenoprotein O (SelO), katalitik HRD motifi^23’te korunmuş aspartattan yoksun, evrimsel olarak korunmuş bir psödokinazdır. Ökaryotlarda SelO mitokondriye lokalize olur ve hücreleri oksidatif stresten korur^24,25. Yapısal ve biyokimyasal analizler, SelO’nun adenozin monofosfatı (AMP) ATP’den protein substratlarına AMPylation²⁵ olarak bilinen bir posttranslasyonel modifikasyonda aktardığını göstermektedir. Son çalışmalar, AMPilasyonu katalize eden enzimlerin UTP gibi alternatif nükleotidleri in vitro ^26,27 bağlayabileceğini göstermektedir. Özellikle, çalışmalar, Salmonella typhimurium’dan elde edilen SelO homologunun, manganez bağımlı bir şekilde protein UMPilasyonunu veya UMP transferini katalize ettiğini göstermiştir²⁸. Bu ilgi çekici gözlemler göz önüne alındığında, SelO’nun ATP ve UTP’ye bağlanmasını magnezyum ve manganez varlığında test ediyoruz ve TSA’nın uygulamalarının temsili bir örneği olarak hizmet ediyoruz. Aşağıdaki protokol, diğer proteinlerin ve ilgili katkı maddelerinin etkileşimlerini optimize etmek ve incelemek için kolayca uyarlanabilir.