サーマルシフトアッセイによるセレノプロテインOへの基質結合のプローブ
Summary
ここでは、低分子の目的のタンパク質への結合を調査するために使用されるハイスループットの蛍光ベースの手法であるサーマルシフトアッセイを紹介します。
Abstract
未知の機能を持つタンパク質の生物学的重要性を定義することは、細胞プロセスの理解において大きな障害となります。バイオインフォマティクスや構造予測は未知のタンパク質の研究に貢献してきましたが、 in vitro での実験的検証は、生化学的活性に必要な最適な条件や補因子によって妨げられることがよくあります。補因子の結合は、一部の酵素の活性に不可欠であるだけでなく、タンパク質の熱安定性を高める可能性もあります。この現象の実用化の1つは、タンパク質の融解温度の変化によって測定される熱安定性の変化を利用して、リガンドの結合を調べることです。
サーマルシフトアッセイ(TSA)は、目的のタンパク質へのさまざまなリガンドの結合を分析したり、X線結晶構造解析などの実験を実行するための安定化条件を見つけたりするために使用できます。ここでは、金属とヌクレオチドの結合を試験するためのシンプルでハイスループットな方法として、シュードキナーゼであるSelenoprotein O(SelO)を利用したTSAのプロトコールについて説明します。標準的なキナーゼとは対照的に、SelOは逆向きにATPに結合し、タンパク質AMPylationとして知られる翻訳後修飾でAMPのタンパク質のヒドロキシル側鎖への移動を触媒します。融解温度の変化を活用することで、SelO機能の根底にある分子相互作用に関する重要な洞察を提供します。
Introduction
ヒトプロテオームの多くは、まだ十分に特徴付けられていません。Dunham氏とKustatscher氏らが提唱した「街灯効果」とは、広く研究されたタンパク質が注目され、研究が進んでいないタンパク質が見落とされる現象を指します1,2。この影響に寄与する要因には、特定のタンパク質の生物学的重要性と疾患関連性が含まれます。さらに、基礎知識を提供する先行研究や、機能解析のためのツールの利用可能性は、高度に研究されているタンパク質の研究をさらに刺激します1,2。Understudy Proteins Initiative、Structural Genomics Consortium、Enzyme Function Initiativeなどのプロジェクトは、構造的および機能的プロテオミクス2,3,4を使用して、研究が進んでいないタンパク質の特性評価を目指しています。研究が進んでいないタンパク質の分子機能を特定するための補完的なアプローチは、これらのタンパク質と低分子との相互作用を調べて、調節と基質特異性に関する貴重な洞察を得ることです。
低分子の結合は、タンパク質の熱安定性を高めることができます5。この現象は、リガンド誘起立立安定化として知られており、しばしばタンパク質の融解温度の上昇をもたらし、リガンド結合の測定可能な指標を提供します6。タンパク質の熱安定性は、Thermometerfluorとも呼ばれる示差走査型蛍光法(DSF)またはThermal Shift Assay(TSA)7,8,9,10を使用して測定できます。TSAでは、タンパク質サンプルは、環境に敏感な色素の存在下で温度上昇にさらされます6。タンパク質が展開して変性すると、色素はタンパク質の露出した疎水性領域に結合し、蛍光を発します。外因性蛍光色素、または環境感受性色素は、内因性蛍光を欠いており、代わりに標的分子と相互作用すると蛍光を発します9,11,12。最も一般的に使用される色素であるSYPRO Orangeは、安定性の向上やバックグラウンド蛍光の少なさなど、いくつかの利点を提供します8,9,12。特に、SYPRO Orangeは、励起波長が約470 nm、発光波長が約570 nmであることから、Real-Time Polymerase Chain Reaction(RT-PCR)システムに適合しています。この独自の機能により、RT-PCRシステムで一般的に使用される蛍光検出システム8と互換性のある、ハイスループット、正確、高感度の測定が可能になります。
TSAは、タンパク質と潜在的な補因子または薬物との相互作用を調査し、結晶構造解析の安定化条件を特定するための汎用性の高いツールです。他のスクリーニング法と比較した場合の利点は、セットアップが比較的簡単であることと、96ウェルまたは384ウェルプレート13,14,15による高いスループットです。この技術の開発は、創薬研究に変革をもたらし、利便性を提供し、イオン、リガンド、薬物などの多様な添加剤の研究を可能にしました6,16。さらに、TSAの適応性は、科学者がその有用性を拡大することを奨励し、スクリーニングアッセイ17,18と並行して結合親和性の測定を容易にする。TSAは、結晶化19のために目的のタンパク質の安定化を促進する条件を特定するための構造生物学研究における効果的なツールです。したがって、その柔軟性と比較的容易さにより、TSAはタンパク質の特性評価の基礎技術として位置付けられています。ここでは、TSAを使用して、研究が進んでいないシュードキナーゼであるセレノプロテインO(SelO)への金属とヌクレオチドの結合を解析します。
キナーゼは、創薬において最も標的とされるタンパク質ファミリーの1つです20。ヒトキナーゼの約10%は、触媒作用に必要な主要な触媒残基を欠いているため、不活性であり、偽キナーゼと名付けられると予測されている21,22。セレノプロテインO(SelO)は、進化的に保存された偽キナーゼであり、触媒的HRDモチーフ23において保存されたアスパラギン酸を欠いている。真核生物では、SelOはミトコンドリアに局在し、細胞を酸化ストレスから保護します24,25。構造解析および生化学的解析により、SelOはAMP化として知られる翻訳後修飾において、ATPからタンパク質基質にアデノシン一リン酸(AMP)を移動させることが示されている25。最近の研究では、AMP化を触媒する酵素がin vitroでUTPなどの代替ヌクレオチドに結合する可能性があることが示されています26,27。特に、サルモネラ・チフス菌由来のSelOホモログが、マンガン依存的にタンパク質UMPylation、またはUMPの転移を触媒することが研究で実証されている28。これらの興味深い観察結果を踏まえて、マグネシウムとマンガンの存在下でのSelOのATPおよびUTPへの結合を試験し、TSAのアプリケーションの代表例となります。以下のプロトコールは、他のタンパク質および目的の添加剤の相互作用を最適化し、調べるために容易に適合させることができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
サーマルシフトアッセイ(TSA)は、補因子や阻害剤との相互作用を含むタンパク質-リガンド相互作用をスクリーニングするための効率的な方法として機能します。このプロトコルでは、TSAを使用して、シュードキナーゼSelOのヌクレオチドおよび二価カチオンへの結合を測定しました。私たちの調査結果は、SelOがATPおよびMg2+/Mn2+の存在下で増加した熱安…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A.S.は、生物医学研究のW.W.Caruth、Jr.奨学生、テキサス州癌予防研究所(CPRIT)奨学生、およびCharles and Jane Pak Center for Mineral Metabolism and Clinical Research Faculty Scholarです。この研究は、NIH Grant K01DK123194 (A.S.)、CPRIT Grant RR190106 (A.S.)、Welch (I-2046-20200401)、Welch (I-2046-20230405) の支援を受けました。
Materials
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma Aldrich | A2383-10G | used for representative results but not required to perfom TSA |
| Avanti J-15R with microplate carrier assembly | Beckman Coulter | C19416 | |
| CFX Opus 384 Real-time PCR system | Bio-Rad | 12011452 | |
| Hard-Shell 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white | Bio-Rad | HSP3805 | |
| Magnesium Chloride | Sigma Aldrich | M8266-100G | used for representative results but not required to perfom TSA |
| Manganese (II) chloride tetrahydrate | Sigma Aldrich | M3634-500G | used for representative results but not required to perfom TSA |
| Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | Bio-Rad | MSB1001 | |
| SYPRO Orange Protein Gel stain | Sigma Aldrich | S5692-500UL | |
| Uridine 5′-triphosphate trisodium salt hydrate | Sigma Aldrich | U6625-100MG | used for representative results but not required to perfom TSA |
References
- Dunham, I. Human genes: Time to follow the roads less traveled. PLoS Biol. 16 (9), e3000034 (2018).
- Kustatscher, G., et al. An open invitation to the understudied proteins initiative. Nat Biotechnol. 40 (6), 815-817 (2022).
- Jones, M. M., et al. The structural genomics consortium: A knowledge platform for drug discovery: A summary. Rand Health Q. 4 (3), 19 (2014).
- Oberg, N., Zallot, R., Gerlt, J. A. Efi-est, efi-gnt, and efi-cgfp: Enzyme function initiative (efi) web resource for genomic enzymology tools. J Mol Biol. 435 (14), 168018 (2023).
- Pace, C. N., Mcgrath, T. Substrate stabilization of lysozyme to thermal and guanidine hydrochloride denaturation. J Biol Chem. 255 (9), 3862-3865 (1980).
- Pantoliano, M. W., et al. High-density miniaturized thermal shift assays as a general strategy for drug discovery. J Biomol Screen. 6 (6), 429-440 (2001).
- Huynh, K., Partch, C. L. Analysis of protein stability and ligand interactions by thermal shift assay. Curr Protoc Protein Sci. 79, 21-29 (2015).
- Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability. Nat Protoc. 2 (9), 2212-2221 (2007).
- Wu, T., et al. Conformationally responsive dyes enable protein-adaptive differential scanning fluorimetry. bioRxiv. , (2023).
- Wu, T., et al. Protocol for performing and optimizing differential scanning fluorimetry experiments. STAR Protoc. 4 (4), 102688 (2023).
- Gao, K., Oerlemans, R., Groves, M. R. Theory and applications of differential scanning fluorimetry in early-stage drug discovery. Biophys Rev. 12 (1), 85-104 (2020).
- Hawe, A., Sutter, M., Jiskoot, W. Extrinsic fluorescent dyes as tools for protein characterization. Pharm Res. 25 (7), 1487-1499 (2008).
- Lucet, I. S., Murphy, J. M. Characterization of ligand binding to pseudokinases using a thermal shift assay. Methods Mol Biol. 1636, 91-104 (2017).
- Murphy, J. M., et al. A robust methodology to subclassify pseudokinases based on their nucleotide-binding properties. Biochem J. 457 (2), 323-334 (2014).
- Senisterra, G., Chau, I., Vedadi, M. Thermal denaturation assays in chemical biology. Assay Drug Dev Technol. 10 (2), 128-136 (2012).
- Lo, M. C., et al. Evaluation of fluorescence-based thermal shift assays for hit identification in drug discovery. Anal Biochem. 332 (1), 153-159 (2004).
- Bai, N., Roder, H., Dickson, A., Karanicolas, J. Isothermal analysis of thermofluor data can readily provide quantitative binding affinities. Sci Rep. 9 (1), 2650 (2019).
- Vivoli, M., Novak, H. R., Littlechild, J. A., Harmer, N. J. Determination of protein-ligand interactions using differential scanning fluorimetry. J Vis Exp. (91), 51809 (2014).
- Vedadi, M., et al. Chemical screening methods to identify ligands that promote protein stability, protein crystallization, and structure determination. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (43), 15835-15840 (2006).
- Taujale, R., et al. Informatic challenges and advances in illuminating the druggable proteome. Drug Discov Today. 29 (3), 103894 (2024).
- Bailey, F. P., Byrne, D. P., Mcskimming, D., Kannan, N., Eyers, P. A. Going for broke: Targeting the human cancer pseudokinome. Biochem J. 465 (2), 195-211 (2015).
- Kung, J. E., Jura, N. Prospects for pharmacological targeting of pseudokinases. Nat Rev Drug Discov. 18 (7), 501-526 (2019).
- Dudkiewicz, M., Szczepinska, T., Grynberg, M., Pawlowski, K. A novel protein kinase-like domain in a selenoprotein, widespread in the tree of life. PLoS One. 7 (2), e32138 (2012).
- Han, S. J., Lee, B. C., Yim, S. H., Gladyshev, V. N., Lee, S. R. Characterization of mammalian selenoprotein o: A redox-active mitochondrial protein. PLoS One. 9 (4), e95518 (2014).
- Sreelatha, A., et al. Protein ampylation by an evolutionarily conserved pseudokinase. Cell. 175 (3), 809-821.e19 (2018).
- Frese, M., et al. The alarmone diadenosine tetraphosphate as a cosubstrate for protein ampylation. Angew Chem Int Ed Engl. 62 (8), e202213279 (2023).
- Mostert, D., et al. Pronucleotide probes reveal a diverging specificity for ampylation vs umpylation of human and bacterial nucleotide transferases. 生物化学. 63 (5), 651-659 (2024).
- Yang, Y., et al. The ydiu domain modulates bacterial stress signaling through Mn2+-dependent umpylation. Cell Rep. 32 (12), 108161 (2020).
- Mukherjee, M., Sreelatha, A. Identification of selenoprotein o substrates using a biotinylated atp analog. Methods Enzymol. 662, 275-296 (2022).
- Kroeger, T., et al. Edta aggregates induce sypro orange-based fluorescence in thermal shift assay. PLoS One. 12 (5), e0177024 (2017).
- Kotov, V., et al. In-depth interrogation of protein thermal unfolding data with moltenprot. Protein Sci. 30 (1), 201-217 (2021).
- Wu, T., Gale-Day, Z. J., Gestwicki, J. E. Dsfworld: A flexible and precise tool to analyze differential scanning fluorimetry data. Protein Sci. 33 (6), e5022 (2024).
- Reinhard, L., Mayerhofer, H., Geerlof, A., Mueller-Dieckmann, J., Weiss, M. S. Optimization of protein buffer cocktails using thermofluor. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 69 (Pt 2), 209-214 (2013).
- Ribeiro, A. J. M., et al. Emerging concepts in pseudoenzyme classification, evolution, and signaling. Sci Signal. 12 (594), eaat9797 (2019).
- Goldberg, T., Sreelatha, A. Emerging functions of pseudoenzymes. Biochem J. 480 (10), 715-728 (2023).
- Pon, A., Osinski, A., Sreelatha, A. Redefining pseudokinases: A look at the untapped enzymatic potential of pseudokinases. IUBMB Life. 75 (4), 370-376 (2023).
- Murphy, J. M., Mace, P. D., Eyers, P. A. Live and let die: Insights into pseudoenzyme mechanisms from structure. Curr Opin Struct Biol. 47, 95-104 (2017).
