带有塑料膜的组织培养小室是细胞培养实验室的黄金标准,可作为建立细胞层和屏障组织模型的渗透性支持物。在此,我们提出了一种简单的方法,用由重组功能化蜘蛛丝蛋白制成的更具生物学相关性的膜代替塑料膜。
复制组织屏障对于生成用于评估新疗法的相关 体外 模型至关重要。今天,这通常使用带有塑料膜的组织培养插入物来完成,该插入物产生顶端和基底侧。除了为细胞提供支持外,这些膜还远非模拟它们的天然对应物基底膜,后者是一种基于蛋白质的纳米纤维基质。在这项工作中,我们展示了一种简单的方法,通过用纯重组功能化蜘蛛丝蛋白制成的塑料膜代替塑料膜来显着提高组织培养插入物的生物学相关性。丝膜通过自组装形成,并会自发粘附在无膜的组织培养插入物上,在那里它可以为细胞提供支持。可以按照实验方案中提供的说明使用标准 3D 打印机打印定制设计的组织培养插入物,也可以购买并使用商业插入物。该方案展示了如何设置插入片段中带有丝膜的培养系统,以及随后如何实施与传统的市售插入片段相同的细胞培养技术。
可以复制组织屏障的体外模型因其在测试新疗法和促进对基本疾病机制的理解方面的适用性而受到越来越多的关注 1,2。为了准确重建天然微环境,概括基底膜 (BM) 的功能至关重要,BM 是一种高度专业化的细胞外基质 (ECM) 复合物。BM 几乎存在于人体的每个组织中,它为内皮细胞和上皮细胞提供支持,并将它们与底层组织分离 2,3。除了提供物理支持外,BM 还调节和维持细胞与周围组织之间的生化信号。这些重要功能使得设计类似于天然 BM3 的结构以及机械和功能特性的支架变得必要。
当今在体外模拟 BM 的最常见方法之一是使用市售的组织培养插入片段 (TC-inserts)。这些本质上是塑料圆柱体,带有可渗透膜,将腔室分为顶端和基底外侧 4,5。虽然易于使用,但商业插件中的膜通常是刚性的、径迹蚀刻的,并且由聚碳酸酯 (PC) 和聚对苯二甲酸乙二醇酯 (PET) 等聚合物制成3,4,6。它们在直径、孔密度和尺寸方面具有柔韧性,可以涂覆以增强细胞粘附,但缺乏 BM 的所有其他相关特性,例如可比的厚度6、互连孔隙率、纤维结构和相关的弹性模量3。
TC 插入物的标准化及其易用性激发了包括我们在内的几个小组用更像体内的对应物取代塑料膜(如表 1 所示)。使用的材料范围从聚二甲基硅氧烷 (PDMS)7、聚(丙交酯-共己内酯)8 和聚己内酯 (PCL)4,9,10 等聚合物到蛋白质材料,如明胶 2,11,12、胶原蛋白 5,13 和重组蜘蛛丝 14,15,16,17.这些材料的膜以各种方式附着在市售的插入物上,从中去除了膜 4,7,8,10,12,13,14,16,18,19,20,21 ,以及通过 3D 打印 1,11,15,17,20 或注塑成型 9,22 制造的定制设计嵌件。然而,这些中的大多数在厚度上仍然与原生 BM 相去甚远,那里的复制品从数百微米11,18 到几微米 5,10,14,21,22 不等。其中许多还需要复杂的形成和/或手动连接方法 1,7,13,14,18,19,21,这使得其他实验室的放大和复制具有挑战性。
在此,我们提出了一种简单的方法来形成丝膜并将其连接到插入物上,并展示了如何在膜的任一侧培养细胞。丝膜是通过 FN-4RepCT (FN-silk) 蛋白在静置溶液的液-气界面处自组装形成的 16,17。FN 丝是来自 Euprosthenops australis 的 Major Ampullulate Spidroin 1 的重组短版本,用源自纤连蛋白23 的 RGD 基序功能化。它已被证明可以组装成纤维状基质,促进细胞粘附、生长和迁移 15,16,17,23,24,25。膜附着在嵌件上的方法依赖于自发粘附,并且已被发现适用于已去除膜的市售嵌件16,以及聚乳酸 (PLA) 17 和 Dental LT15 的 3D 打印嵌件。本文详细介绍了如何将这种方法用于从 Dental LT 打印的嵌件。FN 丝膜附着到插入片段上后,它们基本上可以像标准商业组织培养插入片段一样处理。简而言之,我们提出了一种简单的方法,通过用基于蛋白质的 FN 丝膜代替塑料膜来生成更相关的组织屏障体外模型。
本文描述的方案概述了一种制备生物学相关细胞培养插入物的简单方法。它从打印插入片段开始,然后是 FN 丝膜的形成和附着,最后展示了细胞如何在膜的顶端和基底侧接种。该方案中有一个真正关键的步骤是确保细胞培养的长期成功,那就是将插入物降低和提升到膜上。成功执行这些步骤将产生能够承受细胞培养的丝膜插入培养系统,类似于具有合成膜的市售系统。为了确保这一点,在定制设计的嵌件的侧面安装了导轨,以防止它们在井中倾斜下降或侧向移动,这会导致膜粘附不均匀,产生薄弱点并随后泄漏。第一次遵循协议时出现小问题是很常见的。为了帮助新用户规避这些问题,如果他们在遵循上述协议时遇到这些问题,我们在 表 3 中概述了潜在问题及其解决方案。
膜本身已被证明有利于模拟不同的屏障组织(如 表 2 中概述);然而,应该指出的是,用于打印此处插入片段的树脂尚未对其对其他细胞类型活力的影响进行广泛测试。虽然到目前为止我们还没有遇到任何此类问题,但树脂可能会对一些敏感细胞的活力和生长产生负面影响。因此,建议进行类似于此处介绍的活力测试,以验证填料与所用每种细胞类型的相容性。如果出现细胞毒性,应建立更彻底的固化和/或浸出方案,以防止未固化的单体随着时间的推移而浸出并伤害细胞。可以在 补充文件 2 中找到这种方案的示例,该方案用于打印该方案中用于打印插入片段的树脂。该方案以前已用于制备用于在丝膜上培养 bEnd.3 脑内皮细胞长达 8 天的插入片段15。
本研究中介绍的方法的主要优点是,它提供了一种简单的方法来替换组织培养插入物上的当前塑料膜,从而改善静态组织培养模型。主要限制是用户需要使用 3D 打印设备或在设施中购买时间来打印他们的插页。然而,如有必要,可以通过在去除膜后使用市售组织培养插入物来规避这种情况。此外,虽然丝膜本质上可以用作常规的组织培养插入物,但它们更薄且具有蛋白质成分,因此比目前的合成商业同类产品更敏感。因此,它们需要用户更小心地处理,并且需要保持湿润以保持其弹性。应该注意的是,膜可以承受拉伸和充气16,17,使其适用于模拟呼吸运动等。即便如此,新用户很可能会在初始阶段破坏一些膜,但随着他们的膜处理经验的增加,预计成功率会提高。如果问题仍然存在,用户应参考表 3 进行故障排除。
在过去的十年中,已经提出了几种商业塑料插入物的替代品(表 1),每次比较细胞培养物的性能时,新的、更具生物学相关性的膜都比商业塑料膜产生更好的结果 2,5,6,7,14,22。这主要体现在增强的屏障功能方面 2,5,6,7,14,22,但也体现在形成更像天然的细胞生长14 和在共培养系统中通过膜的相互作用增加 7 .以前在建立血管壁模型时,FN 丝膜已经观察到了这种趋势。在这项研究中,HDMEC 和平滑肌细胞 (SMC) 生长在膜的相对两侧。结果表明,与市售 PET 膜相比,SMC 在 FN 丝膜上与 HDMEC 共培养时分泌更厚的 ECM。同样,HDMEC 在 FN 丝膜上建立了更紧密的屏障17。细胞培养结果的改善可能是由于细胞通讯的改善和更多的体内类似培养条件。FN 丝膜在厚度、结构和机械性能方面更接近天然 BM。天然 BM 在 20 nm 到 3 μm 之间,薄 22 英寸,PET 膜为 10 μm,FN 丝膜约为 1 μm,因此完全属于天然范围。FN 丝膜的结构也是纳米纤维16,就像天然 BM22 一样,而 PET 膜由带有轨迹蚀刻孔的塑料组成,直径通常在 0.4 μm 到 8 μm之间 7。PET 膜的刚性也比 BM 高得多,杨氏模量约为 2 GPa,而 BM 的模量范围为 kPa 至 MPa,但通常约为 250-500 kPa22。FN 丝膜的杨氏模量为 115 kPa16,属于天然条件。还应该注意的是,一旦细胞在膜上生长,它们的强度就成为主导因素,而不是膜本身17。最后,还应该注意的是,FN 丝蛋白的集成功能化确保细胞直接粘附在膜上,因此不需要涂层。对于 PET 膜,通常标配的是涂覆 ECM 蛋白以确保适当的细胞粘附7。
当将 FN 丝膜与用于替代 PET 膜的其他方法进行比较时(如 表 1 所示),我们方法的主要优点是使用重组生产的功能化丝蛋白。这确保了可重复性和确定的培养条件,与其他基于蛋白质的动物源性材料(如胶原蛋白)相比。再次注意,蛋白质的功能化确保不需要涂层,因为细胞可以很好地粘附在膜上,因为它是17。此外,本文描述的丝基膜的生产基于自组装,不需要任何复杂的设置或使用刺激性化学品,这与许多其他依赖于静电纺丝的技术不同。膜自发粘附到小室上,也无需与两部分小室、胶合和硅安装环相关的手动操作,从而简化了放大,并在任何实验室中实现轻松的可重复性。除了简单的生产外,我们的方法还很容易适应用户的实验需求,因为可以使用不同的插入材料,并且可以通过调整初始溶液的丝浓度来调整膜厚度16。最后,据我们所知,该方案可以产生迄今为止附着在组织培养插入物上的最薄的独立膜,从而与天然基底膜最相似。
这里介绍的丝膜形成和处理方案对于习惯于在细胞培养实验室中使用组织培养小室的任何人来说都很容易使用。这是一种从塑料膜过渡到更像 体内的简单方法,它允许使用各种类型的细胞生成更相关的组织模型(表 2)。丝膜可以支持其顶端或基底侧的细胞培养以及双侧不同细胞类型的共培养17。在丝膜上开发的屏障组织模型可用于与组织培养插入物相同的应用范围,包括药物筛选以及渗透和感染研究。对于不同细胞类型之间的串扰值得关注的情况,由于它们在 体内更相似的特性,它们已被证明优于 TC 插入片段17。
The authors have nothing to disclose.
作者要感谢 Spiber Technologies AB 提供重组功能化蜘蛛丝蛋白,感谢 Eline Freeze 打印大部分 3D 打印插入物。
CHEMICALS | |||
Alexa Fluor 488 | Invitrogen; Thermo Fisher Scientific | A-21121 | Goat anti-mouse, Dilution 1:500 |
Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen; Thermo Fisher Scientific | A12379 | Dilution 1:400 |
anti-ZO-1 (1A12) antibody | Invitrogen; Thermo Fisher Scientific | 33-9100 | Mouse anti-human, Monoclonal, Dilution 1:200 |
Dextran, Alexa Fluor 680; 3,000 MW, Anionic | Invitrogen; Thermo Fisher Scientific | D34681 | Diluted 2,5% (w/v) in 200 ul of culture medium |
DMEM/F-12 | Gibco; Thermo Fisher Scientific | 31330095 | Supplemented with 5% v/v FBS and 1% v/v Penicillin-Streptomycin |
Ethanol | Solveco | 1326 | 70% (CAS-no 64-17-5) |
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, United States | Gibco; Thermo Fisher Scientific | 16140071 | |
FN-silk | Spiber technologies AB | Store at -80 °C | |
Isopropanol, EMPARTA ACS analytical reagent | Supelco | 1096342511 | ≥99.5% (CAS-no 67-63-0) |
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen; Thermo Fisher Scientific | L3224 | |
PBS | Swedish Veterinary Agency / Statens veterinärmedicinska anstalt | 992420 | without Ca and Mg, filtered |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco; Thermo Fisher Scientific | 11548876 | |
MATERIAL | |||
Dental LT Clear Resin | Denthouse | #DLCL-01 | |
HaCaT cells | CLS | 300493 | |
Nunc Cell-Culture Treated Multidishes 24-well | Fisher Scientific | 10604903 | |
Nunc Cell-Culture Treated Multidishes 48-wel | Fisher Scientific | 10644901 | |
TC insert, for 24-well plates, PET, transparent | Sarstedt | 83.3932.041 | pore size: 0.4 µm |
ThinCert Cell Culture Inserts, translusent membrane (PET) | Greiner | 662640 | pore size: 0.4 µm |
EQUIPMENT | |||
EVOM meter with chopsticks | World Precision Instruments (WPI) Germany, GMBH | ||
Form 3B | FormLabs | ||
Form Wash | FormLabs | ||
Form Cure | FormLabs | ||
Isotemp General Purpose Deluxe Water Baths | Fisherbrand | ||
Inverted fluorescence microscope Eclipse Ti | Nikon | ||
Inverted fluorescence microscope DMI6000 B | Leica | ||
Laminar flow hood Ninosafe, class II | Labolutions | ||
Midi CO2 Incubator, 40 L | Thermo Scientific |