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生物化学

Ensayo híbrido de conjunto y molécula única para obtener imágenes del movimiento de la CMG totalmente reconstituida

Published: July 26, 2024
doi:
10.3791/67076
, , , , , ,
1Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience,Delft University of Technology, 2Chromosome Replication Laboratory,Francis Crick Institute, 3Department of Physics and Kavli Institute of Nanoscience Discovery,University of Oxford

Summary

Informamos de un ensayo híbrido de conjunto y de una sola molécula para obtener imágenes directas y cuantificar el movimiento de la helicasa Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG) totalmente reconstituida y marcada con fluorescencia en moléculas de ADN lineales mantenidas en su lugar en una trampa óptica.

Abstract

Los eucariotas tienen una helicasa replicativa conocida como CMG, que organiza e impulsa centralmente el replisoma, y lidera el camino al frente de las horquillas de replicación. Obtener una comprensión mecanicista profunda de la dinámica de CMG es fundamental para dilucidar cómo las células logran la enorme tarea de replicar de manera eficiente y precisa todo su genoma una vez por ciclo celular. Las técnicas de una sola molécula son especialmente adecuadas para cuantificar la dinámica de CMG debido a su resolución temporal y espacial sin precedentes. Sin embargo, los estudios de una sola molécula del movimiento de la CMG se han basado hasta ahora en la CMG preformada purificada de las células como un complejo, lo que impide el estudio de los pasos que conducen a su activación. Aquí, describimos un ensayo híbrido de conjunto y molécula única que permitió obtener imágenes a nivel de una sola molécula del movimiento de CMG marcado con fluorescencia después de reconstituir completamente su ensamblaje y activación a partir de 36 polipéptidos diferentes de S. cerevisiae purificados. Este ensayo se basa en la doble funcionalización de los extremos de un sustrato lineal de ADN con dos partes de unión ortogonales, y se puede adaptar para estudiar mecanismos de procesamiento de ADN complejos similares a nivel de una sola molécula.

Introduction

La replicación del ADN en eucariotas se lleva a cabo mediante un complejo proteico dinámico conocido como replisoma1. Un componente clave de este complejo es la helicasa replicativa eucariota Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG), que impulsa y organiza centralmente el replusoma, liderando el camino en la parte delantera de las horquillas de replicación 1,2. Por lo tanto, obtener una comprensión cuantitativa profunda de la dinámica de CMG es fundamental para comprender la dinámica del replisoma. Esta comprensión podría adquirirse con técnicas de molécula única, que son especialmente adecuadas para estudiar motores moleculares, como CMG, debido a su resolución espacial y temporal inigualable, y pueden proporcionarnos una comprensión cuantitativa sin precedentes de su función, estocasticidad y dinámica 2,3,4,5,6,7,8,9.

In vivo, el CMG se carga y se activa de forma separada temporalmente para garantizar que la replicación se produzca solo una vez por ciclo celular 1,10,11. En primer lugar, en la fase G1 del ciclo celular, un conjunto de proteínas conocidas como factores de carga carga el primer componente de la CMG, el complejo hexámero Mcm2-7, en el ADNds 12,13,14,15,16 en forma de hexámeros dobles con una configuración cabeza a cabeza 15,17,18 . En el caso específico de la levadura, este proceso inicial ocurre en secuencias específicas de ADN conocidas como orígenes de replicación1. Aunque Mcm2-7 es el núcleo motor de la helicasa replicativa, por sí mismo es incapaz de desenrollar el ADN19 sin los dos factores activadores de la helicasa, Cdc45 y GINS, que necesitan ser reclutados por el Mcm2-7 cargado para dar lugar a CMG 11,19,20,21 completamente activo. El proceso de activación de la helicasa tiene lugar en la fase S del ciclo celular y comienza con la fosforilación selectiva de los dobles hexámeros Mcm2-7 por la quinasa regulada por el ciclo celular DDK 22,23,24. Estos eventos de fosforilación facilitan el reclutamiento de Cdc45 y GINS a los dobles hexámeros Mcm2-7 10,22,23,24,25,26 por un segundo conjunto de proteínas conocidas como factores de disparo 10,11,26 . La unión de Cdc45 y GINS da lugar a dos helicasas CMG hermanas, que inicialmente encierran ambas hebras del ADN parental y todavía se encuentran en una configuración cabeza a cabeza11,27. En el paso final de activación, el factor de disparo Mcm10 cataliza la extrusión dependiente de la hidrólisis de ATP de una hebra de ADN de cada CMGhermana 11. Después de la extrusión de la hebra, las helicasas hermanas CMG se desvían y se separan entre sí mediante la translocación a lo largo del ssDNA de una manera dependiente de la hidrólisis de ATP 11,20,21,28, desenrollando el ADN al excluir estéricamente la hebra 29 sin translocación. Todo este proceso ha sido completamente reconstituido in vitro a partir de un conjunto mínimo de 36 polipéptidos de S. cerevisiae purificados10,11.

A pesar de la exquisita regulación in vivo del ensamblaje y la activación de CMG descrita anteriormente, los estudios de movimiento de una sola molécula reconstituida in vitro de CMG 2,30,31,32,33,34 se han basado hasta ahora en CMG preactivado purificado como un complejo a partir de células20,21, faltando todos los pasos previos a su activación y la naturaleza bidireccional de su movimiento. Este enfoque de CMG preactivado ha sido el estándar de oro en el campo de una sola molécula, en parte debido a la complejidad bioquímica de la reacción de ensamblaje de CMG completamente reconstituida10,11. Esta reacción bioquímica ha sido difícil de trasladar del nivel bioquímico a granel al nivel de una sola molécula por varias razones. En primer lugar, para maximizar la eficiencia de la reacción, se requieren los factores de carga y disparo necesarios para el ensamblaje y la activación del CMG en concentraciones en el rango de 10-200 nM 10,11,27. Estos rangos de concentración corresponden al extremo superior de lo que la mayoría de las técnicas de una sola molécula pueden tolerar, especialmente cuando se utilizan componentes marcados con fluorescencia35. Finalmente, CMG ha evolucionado para navegar a través de miles de pares de bases en una celda 36,37,38,39. Por lo tanto, para estudiar su movimiento a una escala espacial biológicamente relevante, se requieren sustratos largos de ADN (típicamente de longitudes del orden de decenas de kilobases)30,31,34,40,41,42. El empleo de sustratos de ADN tan largos plantea el desafío adicional de que cuanto más largo es el sustrato de ADN, más sitios de unión no específicos potenciales tiene para las proteínas y los agregados de proteínas. En el caso de la CMG, este último punto es particularmente importante, ya que varios de los factores de carga y disparo implicados en el ensamblaje y la activación de la CMG contienen regiones intrínsecamente desordenadas43 y son propensas a la agregación.

Aquí, reportamos un ensayo híbrido de conjunto y molécula única que permitió la observación y cuantificación del movimiento de CMG después de reconstituir completamente su ensamblaje y activación a partir de 36 polipéptidos de S. cerevisiae purificados28. Este ensayo se basa en la doble funcionalización de ambos extremos de un sustrato de ADN con dos partes de unión ortogonales: destiobiotina y digoxigenina2 (Figura 1A). La primera mitad, la destiobiotina, se utiliza para unir de forma reversible el sustrato del ADN a las perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina44 (Figura 1B). A continuación, se ensambla y activa la CMG marcada con fluorescencia en el ADN unido a las perlas, y se utiliza una gradilla magnética para purificar y lavar los complejos de ADN:CMG ligados a las perlas magnéticas resultantes (Figura 1C). Al hacerlo, se elimina el exceso de proteína que de otro modo se agregaría en el sustrato del ADN; esto proporciona complejos ADN:CMG prácticamente libres de agregación. A continuación, los complejos intactos se eluyen de las perlas magnéticas mediante la adición de un exceso molar de biotina libre, que puede superar la interacción destiobiotina-estreptavidina (Figura 1D). A continuación, los complejos individuales de ADN:CMG se unen entre dos perlas de poliestireno atrapadas ópticamente recubiertas con un anticuerpo anti-digoxigenina (anti-Dig); para este paso, se utiliza la segunda fracción del ADN, la digoxigenina, ya que puede unirse a anti-Dig incluso en una solución tampón que contiene un exceso de biotina libre (Figura 1E). Una vez que el complejo ADN:CMG se mantiene en su lugar en la trampa óptica, se obtiene una imagen del movimiento de la CMG marcada con fluorescencia con un láser de escaneo confocal (Figura 1F). Anticipamos que este ensayo se puede adaptar fácilmente para el estudio a nivel de una sola molécula de interacciones ADN:proteínas igualmente complejas.

Protocol

1. Síntesis de sustrato de ADN lineal doblemente funcionalizado y unión a perlas magnéticas Funcionalización dual del sustrato de ADN con restos de destiobiotina y digoxigeninaLinealizar 20 μg de 23,6 kb de plásmido pGL50-ARS1 (que contiene un origen natural de replicación de ARS1, clonado internamente y disponible bajo pedido) con 200 unidades de enzima de restricción AflII durante 16 h a 37 °C en un volumen final de 200 μL de 1x tampón (50 mM de acetato de potasio, 20 mM de acetato de tris, 10 mM de acetato de magnesio, 100 μg/ml BSA, pH 7,9).NOTA: Este paso se puede reducir a 4 h sin reducir el rendimiento, si es más conveniente. Inactive AflII incubando la reacción a 65 °C durante 20 min. Atenuar los salientes de TTAA de 4 nucleótidos resultantes complementando la reacción de linealización de 200 μL con 60 unidades de polimerasa Klenow Fragment (3′ a 5′ exo-), 17 μL de tampón 10x (500 mM de NaCl, 100 mM de Tris-HCl, 100 mM de MgCl2, 10 mM de DTT, pH 7,9), 33 μM de D-Destiobiotina-7-dATP, 33 μM de Digoxigenina-11-dUTP, 33 μM de dCTP, 33 μM de dGTP, y agua ultrapura hasta un volumen final de 370 μM. Incubar la reacción a 37 °C durante 30 min.NOTA: En este paso, el fragmento de Klenow atenúa los salientes en ambos extremos del ADN linealizado incorporando dos nucleótidos de D-destiobiotina-7-dATP y dos nucleótidos de digoxigenina-11-dUTP en cada extremo. Complemente la reacción con 10 mM de EDTA e inactive el fragmento de Klenow incubando la reacción a 75 °C durante 20 min. Lleve el volumen de reacción a 400 μL con agua ultrapura. Tome cuatro columnas de centrifugación S-400, vórtelas durante al menos 30 s para resuspender la resina y, a continuación, centrilécelas durante 1 minuto a 735 x g para eliminar el tampón de almacenamiento. Transfiera las columnas a tubos limpios de 1,5 ml. Inmediatamente, agregue 100 μL de la solución de ADN a cada columna y centrifugue durante 2 min a 735 x g. El ADN está ahora en el flujo y las columnas pueden ser descartadas. Agrupe el flujo de las cuatro columnas, mida el volumen con una pipeta y mida la concentración de ADN con un espectrofotómetro. Esto se utilizará para calcular la cantidad de ADN unido a las cuentas. Unión de ADN lineal doblemente funcionalizado a perlas magnéticas recubiertas de estreptavidinaVortex M-280 perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina durante 30 s para resuspenderlas. Transfiera 4 mg de perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina M-280 resuspendidas a un tubo limpio de 1,5 ml. Coloque el tubo en una rejilla magnética, espere 1 minuto a que se recojan las cuentas y retire el tampón de almacenamiento. Añada 1 mL de tampón A 1x (5 mM de Tris-HCl pH 7,5, 0,5 mM de EDTA y 1 M de NaCl) a las perlas y vuelva a suspender mediante vórtice durante 5 s. Incuba las perlas a temperatura ambiente durante 5 min.NOTA: Todos los tampones deben filtrarse estérilmente. Haga un gran volumen de 2x buffer A, 1x buffer B (ver abajo) y 1x buffer C (ver abajo) de antemano para ahorrar tiempo (recomendado). Estos tampones son los recomendados por el fabricante de las perlas magnéticas y pueden almacenarse a -20°C. Coloque el tubo en un soporte magnético, espere 1 minuto a que se recojan las perlas y retire el tampón A. Vuelva a suspender las perlas en 400 μL de tampón A 2x pipeteando y, a continuación, añada 400 μL de solución de ADN funcionalizado (tenga en cuenta que esto diluye el tampón A 2x a una concentración final de 1x, que es óptima para la unión del ADN a las perlas). Mezclar suavemente pipeteando. Incubar la mezcla de perlas/ADN durante la noche a 4 °C con rotación de extremo a extremo para permitir que el ADN funcionalizado se una a las perlas. Utilice la gradilla magnética para eliminar el sobrenadante (no lo deseche antes de medir su volumen con una pipeta y la concentración de ADN no unido con un espectrofotómetro) y lave las perlas 2 veces con 500 μL de tampón B (10 mM HEPES-KOH pH 7,6, 1 mM EDTA y 1 M KOAc) para eliminar el ADN no unido específicamente. Lave las perlas 2 veces con 500 μL de tampón C (10 mM HEPES-KOH pH 7,6 y 1 mM EDTA), que es el tampón de almacenamiento recomendado por el fabricante.Calcule la cantidad total de ADN unido a las perlas magnéticas comparando la cantidad total de ADN agregado a las perlas con la cantidad de ADN que queda en el sobrenadante. El rendimiento debe estar en el rango de 2,3-2,9 mg de ADN (~150-190 fmol) por mg de perlas magnéticas. Si se obtienen rendimientos inferiores, compruebe que las columnas S400 no estén secas antes de utilizarlas. Monitoree constantemente la integridad del ADN mediante electroforesis en gel para garantizar que el sustrato inicial del ADN plasmídico no se degrade. Vuelva a suspender las perlas en 300 μL de tampón C y almacene a 4 °C. Para evitar el corte, haga 4 alícuotas de un solo uso de 1 mg de perlas magnéticas y no almacene el ADN durante más de 2 semanas. 2. Ensayo híbrido de conjunto y molécula única para obtener imágenes y cuantificar el movimiento de CMG completamente reconstituido con pinzas ópticas correlativas de doble haz y microscopía confocal Ensamblaje de conjuntos y activación de CMG marcado con fluorescencia en ADN unido a perlas magnéticas (Figura 1C).NOTA: Las reacciones de ensamblaje y activación de CMG se llevaron a cabo en dos etapas: carga y fosforilación de Mcm2-7, y ensamblaje y activación de CMG. A menos que se especifique lo contrario, todos los pasos de intercambio de tampón se llevaron a cabo con la ayuda de un bastidor magnético permitiendo que el imán recogiera las perlas durante 1 minuto y luego retirando el sobrenadante. Todas las incubaciones se llevaron a cabo en un bloque de calor a temperatura controlada con una tapa para evitar el fotoblanqueo de las proteínas fluorescentes. Si no se dispone de una tapa, los tubos deben cubrirse con papel de aluminio. La purificación y el marcaje fluorescente de todas las proteínas empleadas en este protocolo se han llevado a cabo tal y como se ha descrito anteriormente10,11,28.Carga y fosforilación de Mcm2-7Tome 1 mg de perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina unidas al ADN y retire el tampón de almacenamiento (tampón C). Lave las perlas con 200 μL de tampón de carga (25 mM HEPES-KOH pH 7,6, 100 mM de K glutamato, 10 mM de MgOAc, 0,02% de sustituto de NP40, 10% de glicerol, 2 mM de DTT, 100 μg/mL de BSA y 5 mM de ATP). Retire el tampón de carga y vuelva a suspender las perlas en 75 μL de tampón de carga. Mezclar suavemente pipeteando. Añadir ORC a una concentración final de 37,5 nM al ADN unido a las perlas e incubar la reacción durante 5 min a 30 °C con agitación de 800 rpm. Añadir Cdc6 a una concentración final de 50 nM e incubar la reacción durante 5 min a 30 °C con agitación a 800 rpm. Añadir Mcm2-7/Cdt1 (o Mcm2-7JF646-Halo-Mcm3/Cdt1 marcado con fluorescencia) a una concentración final de 100 nM e incubar la reacción durante 20 min a 30 °C con agitación de 800 rpm. Añadir DDK a una concentración final de 100 nM e incubar la reacción durante 30 min a 30 °C con agitación a 800 rpm. Retire el sobrenadante y lave el ADN unido a las perlas (que ahora contiene hexámeros Mcm2-7 fosforilados) con 200 μL de tampón de lavado con alto contenido de sal (HSW) (25 mM HEPES-KOH pH 7,6, 300 mM KCl, 10 mM MgOAc, 0,02% de sustituto de NP40, 10% de glicerol, 1 mM de DTT y 400 μg/mL de BSA). Mezcle mediante pipeteo, asegurándose de que las perlas estén completamente resuspendidas en el tampón y que no se vean grumos. Retire el tampón HSW y lave las perlas una vez con 200 μL de tampón CMG (25 mM HEPES-KOH pH 7,6, 250 mM de glutamato K, 10 mM de MgOAc, 0,02% de sustituto de NP40, 10% de glicerol, 1 mM de DTT y 400 μg/mL de BSA). Ensamblaje y activación de CMG marcado con fluorescenciaRetire el tampón CMG y vuelva a suspender las perlas unidas al ADN en 50 μL de tampón CMG suplementado con 5 mM de ATP. Agregue 50 nM Dpb11, 200 nM GINS, 30 nM Polɛ, 20 nM S-CDK, 50 nM Cdc45LD555, 30 nM Sld3/7, 55 nM Sld2 y 10 nM Mcm10 al ADN unido a perlas. Para este paso, mezcle todas las proteínas en un tubo inmediatamente antes de agregarlas al ADN y colóquelo en hielo. Agregue el ADN unido a perlas resuspendido a la mezcla de proteínas. Incubar la reacción durante 15 min a 30 °C con agitación a 800 rpm. Lave las perlas 3 veces con 200 μL de tampón HSW. Lave las perlas una vez con 200 μL de tampón CMG. Elución de complejos intactos de ADN:CMG a partir de perlas magnéticas (Figura 1D)Elimine el tampón CMG y eluya los complejos ADN:CMG de las perlas magnéticas resuspendiendo las perlas magnéticas unidas al ADN que contienen CMG en 200 μL de tampón de elución (tampón CMG suplementado con 10 mM de biotina). Incubar a temperatura ambiente durante 1 h con agitación de 800 rpm. Coloque el tubo en una rejilla magnética y deje que se recojan las cuentas durante 5 minutos. Recoja cuidadosamente el sobrenadante (que ahora contiene los complejos ADN:CMG eluidos) sin interrumpir las perlas sedimentadas y transfiéralo a un nuevo tubo. Para asegurarse de que no queden perlas en la solución (ya que las perlas magnéticas que quedan en solución pueden interferir con la parte de atrapamiento óptico del ensayo), vuelva a colocar el sobrenadante recogido en una rejilla magnética y deje que se recojan las perlas restantes durante otros 5 minutos. Recoja con cuidado el sobrenadante y transfiéralo a un nuevo tubo. Añadir 1400 μL de tampón CMG a los 200 μL de sobrenadante. La muestra ya está lista para la obtención de imágenes de una sola molécula. Obtención de imágenes de una sola molécula de CMG completamente reconstituida con pinzas ópticas correlativas de doble haz y microscopía confocal (Figura 1E-G).NOTA: La parte de molécula única del ensayo se lleva a cabo en una configuración comercial que combina pinzas ópticas de doble haz con microscopía confocal y microfluídica45,46 (Figura 1E-G), sino que también puede llevarse a cabo en una configuración casera. La configuración comercial utilizada aquí está equipada con una celda de flujo microfluídico con cinco entradas (denominadas canales 1-5, respectivamente) y una salida (Figura 1E). En los pasos que se indican a continuación, todos los nombres de botones y/o paneles son específicos del software que se proporciona con esta configuración comercial.Utilice las cinco entradas en la configuración comercial de la siguiente manera: Inyecte los canales 1-3 desde la izquierda y utilícelos para atrapar perlas (canal 1), unirse al complejo ADN-proteína (canal 2) y verificar la presencia de CMG (canal 3). Utilice los canales 4 y 5 como reservorios de proteínas y lugares de intercambio de tampones. Antes de cada experimento, pasivar la celda de flujo microfluídica durante al menos 30 min con 1 mg/mL de albúmina sérica bovina, seguido de Pluronic F-127 al 0,5% disuelto en agua ultrapura.Asegúrese de que el contenido de cada canal en cada experimento sea el descrito (Figura 1E):Canal 1: Perlas de poliestireno recubiertas de digoxigenina (2,06 μm de diámetro) diluidas 1:50 en PBS;Canal 2: Complejos ADN:CMG eluidos a partir de perlas magnéticas;Canal 3: Tampón de imagen (tampón CMG suplementado con 2 mM de 1,3,5,7 ciclooctatetraeno, 2 mM de 4-nitrobencilalcoholol y 2 mM de Trolox);Canales 4 y 5: Tampón de imagen complementado con RPA de 25 nM, Mcm10 de 10 nM y 5 mM de ATP, 5 mM de ATPγS o ningún nucleótido. Antes del experimento, ajuste la potencia del láser de captura para lograr una rigidez de 0,3 pN/nm en ambas trampas 33,46 haciendo clic en el botón Recalibrar en el panel Controles de potencia del software. Establezca el tamaño de píxel confocal en 50 x 50 nm, el tamaño de la imagen en 160 x 18 píxeles, el tiempo de iluminación por píxel en 0,2 ms y la velocidad de fotogramas en 5 s en el panel Escaneo de imagen del software. Ajuste el control de temperatura a 30 °C en el panel Temperatura.NOTA: Además, recomendamos establecer la velocidad máxima de la etapa (utilizada para moverse entre canales) a 0,2 mm/s para minimizar la disociación de CMG del ADN por la fuerza de arrastre. Haga fluir todas las soluciones en la celda de flujo a una presión constante de 0,5 bar en el puerto de inyección (que se puede configurar en el panel de barra de presión del software). Luego, corte el flujo en los canales 4 y 5. Después de hacer fluir inicialmente todas las soluciones, reduzca la presión a 0,2 bar. Mueva los láseres de captura al canal 1 hasta que se atrape una cuenta en cada trampa óptica. Mueva las cuentas atrapadas al canal 2 moviendo el joystick mientras presiona el gatillo. A continuación, pesca un complejo ADN:CMG moviendo la cuenta derecha hacia y lejos de la cuenta izquierda utilizando el joystick sin pulsar el gatillo, hasta que quede atrapada una correa de ADN (que se conoce monitorizando la curva de fuerza-extensión del ADN atrapado47 en el panel FD Viewer del software).Para el anclaje de ADN, asegúrese de introducir la longitud del ADN y el valor de temperatura correcto en el panel Modelo de referencia, que trazará automáticamente un modelo teórico de cadena extensible en forma de gusano de la construcción de ADN en el panel FD Viewer. Si una sola molécula de ADN queda atrapada entre las dos cuentas, el comportamiento de fuerza-extensión del ADN debe coincidir estrechamente con el modelo de cadena extensible similar a un gusano trazado. Asegúrese de que este sea el caso monitoreando la curva experimental de fuerza-extensión, que el software trazará automáticamente sobre la teórica.NOTA: Las desviaciones del modelo teórico pueden indicar la presencia de múltiples moléculas de ADN unidas entre las perlas y/o la presencia de agregados de proteínas unidos al ADN y compactándolo. Para evitar la disociación mediada por la fuerza de las proteínas del ADN, no exceda una tensión de 10 pN durante esta prueba inicial. Mueva las cuentas al canal 3 e inmediatamente detenga el flujo en todos los canales. Realice un escaneo de prueba de un fotograma en el canal 3 para confirmar la presencia de CMG, iluminando con un láser de 561 nm a una potencia de 4 μW medida en el objetivo. Ajuste las potencias del láser de imagen en el panel Láseres de excitación. Si está presente, CMG aparecerá como puntos bidimensionales limitados por difracción, como se muestra en la Figura 1G y la Figura 2A.Si no se puede atrapar ADN, verifique el canal 2 en busca de burbujas, lo que puede ralentizar el flujo en el canal 2 (en comparación con los canales 1 y 3). Si hay burbujas, aumente la presión en el canal 2 a 1 bar para tratar de enjuagar las burbujas. Si CMG está presente, mueva la correa de ADN al canal 4 o 5 para obtener imágenes; De lo contrario, vuelva a activar el flujo, deseche las cuentas y vuelva al paso 2.2.4. En los canales 4 o 5, ajuste la distancia entre las cuentas para lograr una tensión inicial de 2 pN en la correa de ADN. Para ello, introduzca 2 pN en el panel Espectroscopia de fuerza y haga clic en el botón Activar para iniciar una pinza de fuerza. Una vez que la tensión inicial alcance los 2 pN, desactive la pinza de fuerza antes de obtener imágenes haciendo clic en el botón Habilitar en el panel Espectroscopia de fuerza. Imagen CMGCdc45-LD555 cada 5 s con un láser de 561 nm a una potencia de 4 μW medida en el objetivo (Figura 1F). Para ello, haga clic en el botón Iniciar escaneo en el panel Escaneo de imagen. En dichos escaneos, CMG se mostrará como puntos bidimensionales limitados por difracción, como el ejemplo de la Figura 1G.Si se observa CMG pero no parece moverse antes del blanqueo, pruebe todas las proteínas utilizadas para la actividad de la nucleasa, ya que las muescas en el ADN harán que el CMG se disocie del ADN41, reduciendo severamente su procesividad aparente.NOTA: Una potencia láser de 4 μW debería dar resultados consistentes si se utiliza el microscopio comercial utilizado aquí. Si se utiliza una configuración de construcción casera, recomendamos estimar empíricamente la potencia óptima del láser. Una potencia láser óptima debe proporcionar suficiente señal del fluoróforo para localizarlo con la precisión deseada y una vida útil del fluoróforo cercana al rango de tiempo deseado del experimento.NOTA: Aunque esta publicación se centra en el ensayo híbrido de conjunto y de molécula única, hemos publicado previamente una descripción completa del análisis de los datos generados con este ensayo48.

Representative Results

Cuando se lleva a cabo correctamente, el protocolo descrito aquí debería producir complejos ADN:CMG prácticamente libres de agregados. Una reacción libre de agregación no debería obstruir ninguno de los canales de la celda de flujo microfluídico, y debería ser posible estirar las moléculas de ADN atrapadas hasta una extensión de extremo a extremo dentro del 10% de su longitud de contorno sin romper el ADN. Por el contrario, si hay agregación en la reacción, las moléculas de ADN a veces pueden ser compactadas por los agregados, lo que a menudo causa la rotura del ADN si se estira. Una buena manera de reconocer los agregados de proteínas es observar los escaneos 2D del ADN. En una reacción libre de agregación, la CMG aparece como puntos discretos, simétricos y limitados por la difracción que abarrotan escasamente el ADN, como los de las exploraciones que se muestran en la Figura 2A. Por el contrario, los agregados son menos discretos, a veces manchas asimétricas que se apiñan en una longitud mayor del ADN, como las de los escaneos que se muestran en la Figura 2B. Además, si el ensayo se ejecuta con éxito y se logra una alta pureza de las proteínas purificadas, se observará un movimiento de largo alcance de CMG en presencia de ATP, como se observa en el quimógrafo que se muestra en la Figura 2C. Figura 1: Descripción gráfica del conjunto híbrido y el ensayo de molécula única para obtener imágenes y cuantificar el movimiento de CMG completamente reconstituido. (A) Un ADN lineal de 23,6 kb que contiene un origen de replicación ARS1 natural está doblemente funcionalizado en ambos extremos con restos de destiobiotina y digoxigenina. (B) El ADN doblemente funcionalizado se une a perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina a través de sus fracciones de destiobiotina. (C) CMG se ensambla y activa paso a paso en el ADN unido a perlas magnéticas con diferentes pasos de lavado incluidos para eliminar el exceso de proteínas no unidas y agregados de proteínas. (D) Los complejos intactos de ADN:CMG se eluyen de las perlas magnéticas mediante la adición de un exceso de biotina libre, que supera la interacción destiobiotina-estreptavidina. (E) Los complejos individuales de ADN:CMG se unen entre dos perlas de poliestireno atrapadas ópticamente recubiertas de anti-digoxigenina con la ayuda de una celda de flujo microfluídica. Tenga en cuenta que la interacción Dig-anti-Dig es ortogonal a las interacciones biotina-avidina, por lo que no se ve afectada por la presencia de biotina libre. (F) Una vez mantenidos en su lugar por las pinzas ópticas, los complejos ADN:CMG se transfieren a diferentes condiciones de amortiguación, donde el plano del ADN se escanea con un láser de escaneo confocal para obtener imágenes del movimiento de CMG a lo largo del ADN a lo largo del tiempo. (G) El panel superior muestra un diagrama de un complejo ADN:CMG mantenido en su lugar entre dos perlas de poliestireno recubiertas anti-Dig atrapadas ópticamente que se escanean mediante un láser de escaneo confocal. El panel inferior muestra un ejemplo de escaneo 2D de CMG unido a un ADN mantenido en su lugar con una trampa óptica. El ADN no está marcado en estos experimentos, pero se puede considerar como una línea horizontal que atraviesa el centro de la imagen. Esta cifra ha sido modificada de28. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: Ejemplos de datos de un experimento exitoso y uno fallido. (A) Ejemplo: escaneos 2D de un ADN que contiene CMG en una muestra libre de agregación. En ambas exploraciones, la CMG muestra puntos simétricos y discretos limitados por difracción escasamente distribuidos a lo largo del ADN. (B) Ejemplo: escaneos 2D de un ADN que contiene CMG en una muestra que contiene agregados. En ambas exploraciones, la CMG forma manchas menos simétricas que abarrotan el ADN. (C) Quimógrafo que muestra la posición en el ADN de los puntos limitados por difracción de CMG a lo largo del tiempo en presencia de ATP, que muestra el movimiento de largo alcance de los complejos de CMG. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Pasos críticos e importantes controles de calidad de los reactivos
Aquí se destacan los pasos críticos y los controles de calidad de los reactivos biológicos en el ensayo. En primer lugar, la pureza de las proteínas utilizadas es importante porque la degradación del ADN causada incluso por contaminantes nucleasas pequeños en las muestras de proteínas afectará negativamente a los datos. Esto se debe a que solo las moléculas de ADN intactas (o parcialmente melladas) pueden quedar atrapadas en las pinzas ópticas de doble haz. Más importante aún, las muescas en el ADN harán que CMG se disocie41, lo que complicará la observación del movimiento de largo alcance de CMG. Recomendamos encarecidamente analizar la actividad de la nucleasa de cada proteína purificada, así como supervisar constantemente la integridad del sustrato del plásmido de partida para garantizar que el corte se reduzca al mínimo. El segundo paso importante es la eliminación cuidadosa de las perlas magnéticas después de la elución de los complejos ADN:CMG. La eliminación del sobrenadante en este paso debe realizarse lentamente para no perturbar las perlas recolectadas. Si las perlas magnéticas se dejan en la muestra y se introducen en las pinzas ópticas, a menudo golpean las perlas de poliestireno atrapadas ópticamente, lo que hace que escapen de la trampa óptica y complican la adquisición de datos. Por último, los complejos ADN:CMG deben manipularse con cuidado en las pinzas ópticas. Para ello, se recomienda no aumentar la tensión del ADN por encima de 10 pN, ya que la aplicación de fuerza puede disociar la CMG del ADN. Además, el movimiento entre canales en la celda de flujo microfluídico debe hacerse lo más lentamente posible (~ 0,2 mm/s) para evitar que las fuerzas de arrastre resultantes disocien CMG del ADN.

Modificaciones del método
Hay varios pasos del ensayo que podrían modificarse. Por ejemplo, hemos demostrado que el tiempo de elución puede reducirse de 60 min a 30 min sin afectar significativamente el rendimiento de elución. Además, recomendamos complementar el tampón de elución con una concentración baja (por debajo de 1 mM) de ATP o ATPγS para evitar que la CMG se difunda fuera de los extremos del ADN, así como para estabilizar generalmente la CMG28. Además, aunque las composiciones de tampón y las concentraciones de proteínas que informamos aquí se basan en las empleadas en trabajos bioquímicos y de moléculas individuales anteriores11,18, el ensayo que describimos es totalmente compatible con otros protocolos para ensamblar CMG26,27. Por lo tanto, cualquier avance bioquímico reportado para aumentar la eficiencia del ensamblaje o activación de CMG podría y debería implementarse en la parte más grande del ensayo para aumentar el rendimiento. Por último, al aumentar el tiempo entre fotogramas, aumenta el tiempo total en el que se pueden obtener imágenes de CMG, lo que facilita la observación del movimiento de CMG de largo alcance antes del blanqueo con fluoróforos.

Limitaciones del método
El método híbrido que describimos es limitado en el sentido de que solo se puede obtener una imagen de CMG después de su activación de forma masiva. Se requerirá más trabajo para observar la activación de CMG en tiempo real. Otra limitación importante es que, si bien esperamos que CMG se ensamble en pares 17,26,27, el número total de complejos CMG por ADN que observamos es en su mayoría de uno 28, lo que sugiere que CMG, o al menos Cdc45, se está disociando del ADN durante el manejo de los complejos sensibles ADN:CMG. La reducción del número de pasos de manipulación antes de la obtención de imágenes de una sola molécula, así como el desarrollo de mejores estrategias de pasivación para los tubos de plástico y el vidrio de la celda de flujo microfluídico están preparados para aumentar este rendimiento.

Importancia del método
Hasta ahora, los estudios de movimiento de una sola molécula de CMG han empleado CMG preactivado purificado como un complejo a partir de células. Aunque es relativamente más sencillo, este enfoque de CMG preactivado es limitado en el sentido de que omite alguno de los pasos que conducen a la activación de CMG, así como la naturaleza bidireccional de CMG y el movimiento replisivo. Por otro lado, la reconstitución completa del ensamblaje y la activación de CMG tiene el potencial de estudiar cualquier paso previo a la activación, así como de estudiar el movimiento de CMG de manera bidireccional. Sin embargo, este enfoque es más difícil de trasladar del nivel bioquímico a granel al nivel de una sola molécula, ya que implica factores y pasos de proteínas mucho más purificados. El ensayo que describimos aquí ha ayudado a superar estos desafíos al permitirnos obtener imágenes del movimiento de CMG completamente reconstituido a nivel de una sola molécula, lo que nos permite acceder a algunas dinámicas de preactivación que anteriormente se habían perdido28. Además, aunque en la mayoría de los casos vemos un CMG por ADN, pudimos observar varios casos de dos complejos CMG moviéndose en direcciones opuestas, e incluso pudimos capturar la separación inicial de los CMG hermanos entre sí28, lo que proporciona algunas ideas sobre el establecimiento de la replicación bidireccional.

Otra ventaja de este ensayo en comparación con el movimiento anterior de CMG radica en la naturaleza totalmente bicatenaria del sustrato de ADN que empleamos (Figura 1A). En trabajos previos de CMG preactivado, la forma más común de unir CMG al sustrato de ADN es a través de un colgajo de ssDNA de 3′. Esto da como resultado una construcción de ADN que no puede ser fácilmente restringida por torsión y, por lo tanto, prohíbe el estudio del papel del superenrollamiento en la progresión replisómica. Por el contrario, el nuevo enfoque que describimos aquí podría tener el potencial de adaptarse para estudiar el papel del par en este proceso, ya que el sustrato de ADN utilizado es completamente bicatenario.

Aplicaciones más amplias del método
El ensayo híbrido descrito allanará el camino hacia la reconstitución completa de un replisoma eucariota completo, lo que nos permitirá a nosotros y a otros observar y cuantificar las dinámicas importantes que permiten que el replisoma tenga éxito en todas sus diferentes tareas. Dejando a un lado la replicación del ADN, el ensayo que presentamos representa un avance importante en la traducción de una reacción bioquímica complicada del nivel bioquímico a granel al nivel de una sola molécula. Anticipamos que este ensayo puede modificarse fácilmente para estudiar interacciones ADN:proteínas igualmente complejas involucradas en diferentes mecanismos de procesamiento del ADN.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores agradecen a Anne Early, Lucy Drury y Max Douglas por proporcionar cepas de levadura para la sobreexpresión de proteínas no marcadas, así como a los miembros del laboratorio de N.D. Anuj Kumar, Katinka Ligthart y Julien Gros por su ayuda para purificar los factores de carga y el DDK. Los autores también agradecen a Kaley McCluskey, Dorian Mikolajczak, Joseph Yeeles, Jacob Lewis, Alessandro Costa, Hasan Yardimci y Taekjip Ha por sus útiles discusiones científicas. D.R.M. agradece la financiación de una beca de doctorado del Boehringer Ingelheim Fonds.  N.D. agradece la financiación de la Organización Holandesa para la Investigación Científica (NWO) a través de la subvención Top 714.017.002 y del Consejo Europeo de Investigación a través de una Subvención Avanzada (REPLICHROMA; número de subvención 789267).

Materials

AflII  NEB R0520L
Anti-digoxigenin coated polystyrene beads  Spheroteck DIGP-20-2
ATP solution Thermo Fisher R0441
ATPγS Roche 11162306001
BSA NEB B9000S
C-Trap Lumicks
CutSmart Buffer NEB B6004S Provided with AflII
dCTP Promega U122B
D-Desthiobiotin-7-dATP Jena Bioscience  NU-835-Desthiobio
dGTP Thermo Fisher 10218014
Digoxigenin-11-dUTP Jena Bioscience NU-803-DIGXL
Dynabeads M-280 Streptavidin magnetic beads Invitrogen 11205D
Klenow Fragment (3'→5' exo-)  NEB M0212L
Microspin S-400 HR spin columns  GE Healthcare GE27-5140-01
NEBuffer2 NEB B7002S Provided with Klenow Fragment
Nonidet P 40 Substitute Sigma 74385
Pluronic F-127  Sigma P2443
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Ramírez Montero, D., Sánchez, H., van Veen, E., van Laar, T., Solano, B., Diffley, J. F. X., Dekker, N. H. Hybrid Ensemble and Single-molecule Assay to Image the Motion of Fully Reconstituted CMG. J. Vis. Exp. (209), e67076, doi:10.3791/67076 (2024).
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