Imunoensaio de fluxo lateral fluorescente baseado em nanoesferas de pontos quânticos
Summary
Aqui, descrevemos um protocolo para a preparação de nanoesferas de pontos quânticos (QDNB) e a detecção de biomarcadores de doenças usando tiras de imunoensaio de fluxo lateral baseadas em QDNB. Os resultados do teste podem ser avaliados qualitativamente sob iluminação de luz UV e medidos quantitativamente usando um leitor de tiras fluorescentes em 15 minutos.
Abstract
Os pontos quânticos, também conhecidos como nanocristais semicondutores, são novos rótulos fluorescentes para imagens e sensores biológicos. No entanto, conjugados de anticorpo de ponto quântico com pequenas dimensões (~ 10 nm), preparados por meio de procedimentos de purificação trabalhosos, exibem sensibilidade limitada na detecção de certos marcadores de doenças vestigiais usando tiras de imunoensaio de fluxo lateral. Aqui, apresentamos um método para a preparação de nanoesferas de pontos quânticos (QDNB) usando um método de evaporação de emulsão de uma etapa. Usando o QDNB preparado, um imunoensaio fluorescente de fluxo lateral foi fabricado para detectar biomarcadores de doenças usando proteína C-reativa (PCR) como exemplo. Ao contrário das nanopartículas de ponto quântico único, os conjugados de nanoesferas de pontos quânticos e anticorpos são mais sensíveis como marcadores de imunoensaio devido à amplificação do sinal, encapsulando centenas de pontos quânticos em uma nanoesfera composta de polímero. Além disso, o tamanho maior dos QDNBs facilita a separação por centrifugação ao conjugar QDNBs com anticorpos. O imunoensaio fluorescente de fluxo lateral baseado em QDNBs foi confeccionado, e a concentração de PCR na amostra foi medida em 15 min. Os resultados do teste podem ser avaliados qualitativamente sob iluminação de luz UV e medidos quantitativamente usando um leitor fluorescente em 15 minutos.
Introduction
As tiras de imunoensaio de fluxo lateral (LFIA) servem como ferramentas cruciais de detecção rápida no local de atendimento 1,2, particularmente na triagem de doenças durante epidemias. No entanto, as tiras de teste LFIA tradicionais à base de ouro coloidal exibem baixa sensibilidade de detecção e fornecem apenas resultados qualitativos3. Para aumentar a sensibilidade de detecção do LFIA, surgiram várias novas nanopartículas, incluindo látex colorido 4,5, nanopartículas fluorescentes de conversão ascendente6, microesferas fluorescentes resolvidas no tempo 7,8 e pontos quânticos 9,10,11. Os pontos quânticos (QDs)12,13, também conhecidos como nanocristais semicondutores, oferecem comprimentos de onda de emissão ajustáveis, uma ampla faixa de excitação e alta eficiência de luminescência, tornando-os rótulos ideais para imagens biológicas.
No entanto, o sinal de fluorescência emitido por pontos quânticos individuais permanece fraco, resultando em sensibilidade de detecção relativamente baixa em imunoensaios. O encapsulamento de vários pontos quânticos dentro de microesferas pode amplificar sinais e melhorar a sensibilidade dos imunoensaios baseados em pontos quânticos. Vários métodos, como automontagem camada por camada 14,15,16,17,18, o método de inchaço19,20 e o encapsulamento da microesfera de sílica 21,22,23,24, foram empregados para encapsular pontos quânticos dentro de microesferas. Por exemplo, marcadores de nanoesferas de sílica funcionalizados por pontos quânticos podem ser alcançados aumentando a carga de QD por imunorreação25 imprensada. Um secador por pulverização equipado com um atomizador ultrassônico também foi usado para preparar nanoesferas QD-BSA em nanoescala26. No entanto, os métodos mencionados acima sofrem de multietapas complexas, têmpera de fluorescência e baixa produtividade.
Em nosso trabalho anterior27, foi relatado um método de evaporação de emulsão-solvente para encapsular pontos quânticos dentro de nanoesferas de polímero. Essa técnica de preparação é simples, mantém a eficiência fluorescente dos QDs, garante alta eficiência de encapsulamento e permite uma produção fácil e escalável. Vários grupos de pesquisa desenvolveram com sucesso tiras LFIA usando QDNBs preparados por meio desse método para aplicações, incluindo detecção de toxinas alimentares 28,29,30, detecção de biomarcadores de doenças infecciosas 31,32 e monitoramento ambiental33.
Este protocolo apresenta etapas específicas de preparação para nanoesferas de pontos quânticos (QDNB), conjugação de QDNB e anticorpos, preparação de LFIA baseada em QDNB e medição de proteína C reativa (PCR) em amostras de plasma humano.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, descrevemos um protocolo para a preparação de nanoesferas de pontos quânticos (QDNB)27 e o uso de QDNB para a preparação de imunoensaios fluorescentes de fluxo lateral (LFIA). A medição qualitativa e quantitativa da PCR em amostras é demonstrada. Este LFIA baseado em QDNB também pode ser aplicado a outros biomarcadores de doenças25,32, toxinas alimentares29,30, vír…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Projeto do Comitê de Ciência e Tecnologia de Xangai (STCSM) (22S31902000) e pelo Programa de Incubação de Pesquisa Clínica do Hospital de Doenças de Pele de Xangai (NO. lcfy2021-10).
Materials
| (dimethylamino)propyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 03450 | |
| Absorbance paper | Kinbio Biotech | CH37K | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | B2064 | |
| Casein | Sigma-Aldrich | C8654 | |
| CdSe/ZnS quantum dot | Suzhou Mesolight Inc. | CdSe/ZnS-625 | |
| Choloroform | Sino Pharm | 10006818 | |
| CRP antibody | Hytest Biotech | 4C28 | |
| Fluorescent lateral flow assay reader | Suzhou Helmence Precision Instrument | FIC-H1 | |
| Glass fiber pad | Kinbio Biotech | SB06 | |
| Goat anti-rabbit IgG | Sangon Biotech | D111018 | |
| Nitrocellulose membrane | Satorious | CN140 | |
| Poly(styrene-maleic anhydride) copolymer | Sigma-Aldrich | S458066 | |
| Rabbit IgG | Sangon Biotech | D110502 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sino Pharm | 30166428 | |
| Sodium hydroxide | Sino Pharm | 10019718 |
References
- de Puig, H., Bosch, I., Gehrke, L., Hamad-Schifferli, K. Challenges of the nano-bio interface in lateral flow and dipstick immunoassays. Trends Biotechnol. 35 (12), 1169-1180 (2017).
- Miller, B. S., et al. Spin-enhanced nanodiamond biosensing for ultrasensitive diagnostics. Nature. 587 (7835), 588-593 (2020).
- Gao, Z., et al. Platinum-decorated gold nanoparticles with dual functionalities for ultrasensitive colorimetric in vitro diagnostics. Nano Lett. 17 (9), 5572-5579 (2017).
- Fan, L., et al. Deeply-dyed nanobead system for rapid lateral flow assay testing of drugs at point-of-care. Sensors Actuators B Chem. 362, 131829 (2022).
- Garcia, V. S., Guerrero, S. A., Gugliotta, L. M., Gonzalez, V. D. G. A lateral flow immunoassay based on colored latex particles for detection of canine visceral leishmaniasis. Acta Trop. 212, 105643 (2020).
- You, M., et al. Household fluorescent lateral flow strip platform for sensitive and quantitative prognosis of heart failure using dual-color upconversion nanoparticles. ACS Nano. 11 (6), 6261-6270 (2017).
- Ye, Z., Tan, M., Wang, G., Yuan, J. Novel fluorescent europium chelate-doped silica nanoparticles: preparation, characterization and time-resolved fluorometric application. J Mater Chem. 14 (5), 851 (2004).
- Xu, Y., Li, Q. Multiple fluorescent labeling of silica nanoparticles with lanthanide chelates for highly sensitive time-resolved immunofluorometric assays. Clin Chem. 53 (8), 1503-1510 (2007).
- Zhang, B., et al. Improving detection sensitivity by oriented bioconjugation of antibodies to quantum dots with a flexible spacer arm for immunoassay. RSC Adv. 6 (55), 50119-50127 (2016).
- Li, Z., et al. Rapid and sensitive detection of protein biomarker using a portable fluorescence biosensor based on quantum dots and a lateral flow test strip. Anal Chem. 82 (16), 7008-7014 (2010).
- Wang, L., et al. Fluorescent strip sensor for rapid determination of toxins. Chem Commun. 47 (5), 1574-1576 (2011).
- Medintz, I. L., Uyeda, H. T., Goldman, E. R., Mattoussi, H. Quantum dot bioconjugates for imaging, labeling and sensing. Nat Mater. 4 (6), 435-446 (2005).
- Smith, A. M., Nie, S. Compact quantum dots for single-molecule imaging. J Vis Exp. 68, e4236 (2012).
- Wang, C., et al. Layer-by-layer assembly of magnetic-core dual quantum dot-shell nanocomposites for fluorescence lateral flow detection of bacteria. Nanoscale. 12 (2), 795-807 (2020).
- Hu, J., Tang, F., Jiang, Y. Z., Liu, C. Rapid screening and quantitative detection of Salmonella using a quantum dot nanobead-based biosensor. Analyst. 145 (6), 2184-2190 (2020).
- Wang, W., et al. Introduction of graphene oxide-supported multilayer-quantum dots nanofilm into multiplex lateral flow immunoassay: A rapid and ultrasensitive point-of-care testing technique for multiple respiratory viruses. Nano Res. 16 (2), 3063-3073 (2023).
- Wang, C., et al. Colorimetric-fluorescent dual-signal enhancement immunochromatographic assay based on molybdenum disulfide-supported quantum dot nanosheets for the point-of-care testing of monkeypox virus. Chem Eng J. 472, 144889 (2023).
- Zheng, S., et al. Dual-color MoS2@QD nanosheets mediated dual-mode lateral flow immunoassay for flexible and ultrasensitive detection of multiple drug residues. Sensors Actuators B Chem. 403, 135142 (2024).
- Wang, G., et al. Efficient incorporation of quantum dots into porous microspheres through a solvent-evaporation approach. Langmuir. 28 (14), 6141-6150 (2012).
- Li, H., et al. Fluorescent lateral flow immunoassay for highly sensitive detection of eight anticoagulant rodenticides based on cadmium-free quantum dot-encapsulated nanospheres. Sensors Actuators B Chem. 324, 128771 (2020).
- Gao, F., et al. Rational design of dendritic mesoporous silica nanoparticles’ surface chemistry for quantum dot enrichment and an ultrasensitive lateral flow immunoassay. ACS Appl Mater Interfaces. 13 (18), 21507-21515 (2021).
- Xu, L. D., Zhu, J., Ding, S. N. Immunoassay of SARS-CoV-2 nucleocapsid proteins using novel red emission-enhanced carbon dot-based silica spheres. Analyst. 146 (16), 5055-5060 (2021).
- Tao, S., et al. SARS-Cov-2 Spike-S1 antigen test strip with high sensitivity endowed by high-affinity antibodies and brightly fluorescent QDs/silica nanospheres. ACS Appl Mater Interfaces. 15 (23), 27612-27623 (2023).
- Wang, C., et al. Development of an ultrasensitive fluorescent immunochromatographic assay based on multilayer quantum dot nanobead for simultaneous detection of SARS-CoV-2 antigen and influenza A virus. Sensors Actuators B Chem. 345, 130372 (2021).
- Chen, L., Chen, C., Li, R., Li, Y., Liu, S. CdTe quantum dot functionalized silica nanosphere labels for ultrasensitive detection of biomarker. Chem Commun. 19, 2670-2672 (2009).
- Chu, M., et al. A novel method for preparing quantum dot nanospheres with narrow size distribution. Nanoscale. 2 (4), 542-547 (2010).
- Zhang, P., Lu, H., Chen, J., Han, H., Ma, W. Simple and sensitive detection of HBsAg by using a quantum dots nanobeads based dot-blot immunoassay. Theranostics. 4 (3), 307-315 (2014).
- Ouyang, S., et al. An on-site, ultra-sensitive, quantitative sensing method for the determination of total aflatoxin in peanut and rice based on quantum dot nanobeads strip. Toxins. 9 (4), 137 (2017).
- Liu, J., et al. Quantitative ciprofloxacin on-site rapid detections using quantum dot microsphere based immunochromatographic test strips. Food Chem. 335, 127596 (2021).
- Chen, Y., Fu, Q., Xie, J., Wang, H., Tang, Y. Development of a high sensitivity quantum dot-based fluorescent quenching lateral flow assay for the detection of zearalenone. Anal Bioanal Chem. 411 (10), 2169-2175 (2019).
- Zhang, Q., et al. SARS-CoV-2 detection using quantum dot fluorescence immunochromatography combined with isothermal amplification and CRISPR/Cas13a. Biosens Bioelectron. 202, 113978 (2022).
- Zhong, X., et al. CRISPR-based quantum dot nanobead lateral flow assay for facile detection of varicella-zoster virus. Appl Microbiol Biotechnol. 107 (10), 3319-3328 (2023).
- Liu, Y., Xiao, M., Xu, N., Yang, M., Yi, C. Point-of-need quantitation of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid using a ratiometric fluorescent nanoprobe and a smartphone-based sensing system. Sensors Actuators B Chem. 367, 132083 (2022).
- McCafferty, C., et al. Blood collection processing and handling for plasma and serum proteomics BT – Serum/plasma proteomics. Methods Mol Biol. 2628, 33-40 (2023).
- Zhang, P., et al. Rapid and quantitative detection of C-reactive protein based on quantum dots and immunofiltration assay. Int J Nanomedicine. 10, 6161-6173 (2015).
- Hu, J., et al. Sensitive and quantitative detection of C-reaction protein based on immunofluorescent nanospheres coupled with lateral flow test strip. Anal Chem. 88 (12), 6577-6584 (2016).
- Fan, L., et al. One-component dual-readout aggregation-induced emission nanobeads for qualitative and quantitative detection of c-reactive protein at the point of care. Anal Chem. 96 (1), 401-408 (2024).
- Gui, Y., et al. Colorimetric and reverse fluorescence dual-signal readout immunochromatographic assay for the sensitive determination of sibutramine. ACS Omega. 9 (6), 7075-7084 (2024).
