İnce Tabaka Kromatografisi-Doğrudan Biyootoografi ile Biyokontrol için Doğal Ürünlerin Biyotahlil Kılavuzluğunda Tanımlanması

Bu çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir. 1. Mikrobiyal biyokontrol adaylarının seçilmesi Rekabet plakası tahlillerini kullanarak, ilgilenilen patojene karşı antagonizma gösteren mikrobiyal izolatları seçin.NOT: Bu protokolü göstermek için Bacillus atrophaeus, mojavensis ve subtilis türleri de dahil olmak üzere S. sclerotiorum’a karşı antagonizma sergileyen dokuz Bacillus izolatı seçilmiştir. 2. Medya hazırlığı Litre suya 39 g orta maddeyi çözerek patates dekstroz agar (PDA) hazırlayın. Bir litre suya 45 g ortam ekleyerek Pseudomonas F agar’ı hazırlayın. Litre suya 24 g orta ve 0.24 g agar ekleyerek% 1 agar ile patates dekstroz suyu (PDB) hazırlayın. Maya-glikoz-manganez (YGM) suyu hazırlayın. 100 mL su içinde 2.5 g KH2PO4 ve 2.5 g K2HPO4 ve 0.58 g MnS04 içeren bir tuz çözeltisinden oluşan bir tampon çözelti oluşturun. 100 mL su içinde H20, 0.5 g NaCl ve 0.05 g FeSO 4.7H20.Daha sonra, metal tuzlarının çözelti içinde çökelmemesini sağlamak için 1 g maya özütü, 1.25 g dekstroz, 400 mL su, 5 mL tampon çözeltisi, 5 mL tuz çözeltisi ve 90 mL su ekleyin. Ortamı otoklavla sterilize edin, agarı 100 x 15 mm Petri plakalarına dökün ve kullanmadan önce oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. 3. Patojen hazırlama Beş tabak Sclerotinia sclerotiorum’u PDA (adım 2.1’de hazırlanan) üzerinde kültürleyin ve 3 gün boyunca 25 ° C’de inkübe edin. 4. Doğal ürün özü hazırlama Her bakteri izolatını Pseudomonas F Agar (adım 2.2’de hazırlanmıştır) üzerinde kültürleyin ve tek tek koloniler gözlenene kadar büyütün. Tek bakteri kolonilerini santrifüj veya kültür tüplerinde 25 mL YGM ortamına subkültür yapın ve 3 gün çalkalayarak inkübe edin. Her ekstraktın 5 mL alikotunu 1 L YGM’ye aktarın ve aynı koşullarda 3 gün daha inkübe edin. Hücreleri peletlemek için her kültürü 3000 x g’da 25 ° C’de 15 dakika santrifüjleyin. Kültür ortamından metabolitleri çıkarmak için süpernatanı üç kez boşaltın ve etil asetat ile yıkayın. Döner buharlaştırma kullanarak her birinin etil asetat tabakasını birleştirin ve kurutun. Ekstraktı minimum metanol içinde yeniden çözün, küçük bir sintilasyon şişesine aktarın ve döner buharlaştırma ile tekrar kurutun.NOT: Ekstrakt yağlı veya reçineli bir malzemeye kurursa, doğru bir şekilde tartılabilen kuru bir toz elde etmek için malzemeyi liyofilize edin. 5. TLC plaka hazırlama 20 cm x 20 cm TLC plakayı, plakanın altından 2 cm ve üstünden 2 cm bir çizgi çizerek hazırlayın. Alt satıra, 2 cm aralıklarla dokuz nokta yerleştirin. Üst çizginin üzerine 4 cm aralıklarla dört nokta yerleştirin. Her ekstraktın 5 mg’ını 15 μL metanol içinde çözün ve bir pipet kullanarak alt satırda işaretlenmiş dokuz noktaya her ekstrakttan 5 μL uygulayın. Her bir ekstrakt noktasını TLC plakasında kurumaya bırakın ve aynı noktaya 5 μL daha alikot uygulayın. Tüm malzeme TLC plakasına yüklenene kadar tekrarlayın. TLC plakasını, çözücü plakanın üstünden 2 cm uzakta işaretlenen çizgiye ulaşana kadar (yaklaşık 45 dakika) 1: 2 diklorometan ve metanol çözeltisi kullanarak gelişmekte olan bir tankta geliştirin. Geliştirildikten sonra, TLC plakasını çıkarın ve çözücü çizgisinin üzerinde işaretlenmiş dört nokta üzerinde bir dizi pozitif kontrol uygulayın. Aynı kontrolün dört konsantrasyonu kullanılır. S. scl. için 0.5 μg/mL, 5 μg/mL, 50 μg/mL ve 500 μg/mL Higromisin B pozitif kontrollerdir. Tüm çözücü plakadan buharlaşmadan önce, etanol ile sterilize edilmiş bir TLC plaka kutusuna yerleştirin. 6. Doğrudan biyootografi testi Tahlilde kullanılacak malzemeleri (kromatografi püskürtücünün cam bileşenleri, metal spatula, dört yaprak kağıt havlu, selüloz veya filtre kağıdı, su ve ortam) teneke ile kaplı büyük bir beherde otoklavlayın.NOT: Kağıt malzemeler (kağıt havlu, selüloz kağıt) otoklavda ıslanmamak için kalay folyoya sarılmalıdır. Etanol ile sterilize edilmiş PTFE boru kullanarak bir hava kaynağı, basınç göstergesi ve kromatografi püskürtücü bağlayın. Kromatografi püskürtücü ile manometre arasına bir HEPA filtresi bağlayın. Steril metal spatula kullanarak beş patojen plakasının misel matını steril bir spatula kullanarak 50 mL’lik bir santrifüj tüpüne toplayın.NOT: Gerekirse miselin yerinden çıkmasına yardımcı olmak için az miktarda sıvı et suyu kullanın ve steril bir pipetle aktarın. 50 mL santrifüj tüpüne agar ve steril cam boncuklarla modifiye edilmiş 25 mL PDB ekleyin ve misel matını parçalamak için 5 dakika vorteksleyin. Büyük misel parçalarının kromatografi püskürtücüyü tıkamamasını sağlamak için iğne ucu olan steril bir şırınga kullanarak misel süspansiyonunu bir kromatografi püskürtücüsüne aktarın. Ortam süspansiyonunu uygularken plaka ile el temasını azaltmak için önceden geliştirilmiş TLC plakalarını laminer akışlı bir başlıkta steril kağıt havluların üzerine yerleştirin. Hava basıncını yaklaşık 4 bar’a yükseltin ve TLC plakasına üç kat süspansiyon uygulayın, böylece plakanın uygulamalar arasında tamamen kurumasını sağlayın.NOT: Üç katmanın en uygun miktar olduğu bulunmuştur. Bundan daha azı ve patojenin büyümesi için yeterli ortamı yoktur. Bundan daha fazlası, ortam çok kalındır ve bu da aktif metabolitlerle patojen temasına izin vermeyebilir. Sterilize edilmiş bir plastik tabak kutusuna 500 mL steril su ekleyin ve nemi tutmak için her iki tarafa sterilize edilmiş katlanmış selüloz levhalar veya filtre kağıdı yerleştirin. Doldurulmuş tahlil plakasını kutudaki dört boş Petri kabına yerleştirin. Testi 3 gün ila 1 hafta boyunca veya pozitif kontroller ve inhibisyon bölgesi (ZOI’ler) dışında TLC plakası boyunca eşit bir misel tabakası eşit şekilde büyüyene kadar inkübe edin. 7. Sıvı kromatografisi kütle spektrometresi analizi Tamamlanan tahlili fotoğraf kullanarak görüntüleyin. Alt satırdan ZOI’ye olan mesafeyi, alt satırdan üst satıra olan mesafeye bölerek her bir inhibisyon bölgesi için tutma faktörünü hesaplayın. Silikayı inhibisyon bölgelerinden kazıyın ve mikrosantrifüj tüplerine yerleştirin. Her tüpe 500 μL metanol ekleyin ve metabolitleri silikadan çıkarmak için girdap yapın. 10 dakika boyunca 20 ° C’de 8.500 x g’da santrifüjleyin ve süpernatanı küçük bir şişeye aktarın. Döner buharlaştırma veya bir nitrojen akışı altında kuruyana kadar buharlaştırın. Ekstraktı bir LC şişesinde 50 μL metanol içinde yeniden süspanse edin. LC-MS ile inhibisyon bölgesindeki metabolitleri analiz edin ve ham ekstrakttaki hangi metabolitlerin patojenin16 inhibisyonundan sorumlu olduğunu belirlemek için bunları ham ekstrakttaki metabolitlerle karşılaştırın. Kaynak mikroorganizmanın cinsini ve türünü ve ZOI’de tanımlanan kitleleri kullanarak, metabolitleri tanımlamak için literatürü ve Antibase ve Doğal Ürünler Sözlüğü gibi ilgili veritabanlarını araştırın.