تحديد الخلايا التائية النادرة الخاصة بالمستضد من رئتي الفأر مع الببتيد: رباعيات التوافق النسيجي المعقدة الرئيسية
Summary
نحن نقدم بروتوكولا مفصلا لعزل وتحديد مجموعات الخلايا التائية النادرة الخاصة بالمستضد في رئتي الفئران من خلال إثراء الخلايا التائية القائمة على الخرزة المغناطيسية والببتيد: رباعيات معقد التوافق النسيجي الرئيسي (MHC).
Abstract
يظل تحديد وتوصيف الخلايا التائية الخاصة بالمستضد أثناء الصحة والمرض مفتاحا لتحسين فهمنا للفيزيولوجيا المرضية المناعية. تم تطوير التحديات التقنية لتتبع مجموعات الخلايا التائية الخاصة بالمستضد داخل ذخيرة الخلايا التائية الداخلية بشكل كبير من خلال تطوير الببتيد: كواشف رباعي MHC. ترتبط هذه المتعددات القابلة للذوبان ذات العلامات الفلورية لجزيئات MHC من الفئة الأولى أو الفئة الثانية المعقدة إلى حواتم الببتيد المستضدية مباشرة بالخلايا التائية ذات خصوصية مستقبلات الخلايا التائية المقابلة (TCR) ، وبالتالي يمكنها تحديد مجموعات الخلايا التائية الخاصة بالمستضد في حالتها الأصلية دون الحاجة إلى استجابة وظيفية ناتجة عن خارج الجسم الحي التحفيز. بالنسبة للمجموعات النادرة للغاية ، يمكن إثراء الخلايا التائية المرتبطة برباعي مغناطيسيا لزيادة حساسية وموثوقية الكشف.
مع تعمق فحص مناعة الخلايا التائية المقيمة في الأنسجة، هناك حاجة ملحة لتحديد الخلايا التائية الخاصة بمولد الضد التي تنتقل إلى الأنسجة غير اللمفاوية وتعيش فيها. في هذا البروتوكول ، نقدم مجموعة مفصلة من التعليمات لعزل وتوصيف الخلايا التائية الخاصة بالمستضد الموجودة داخل رئتي الفأر. يتضمن ذلك عزل الخلايا التائية من أنسجة الرئة المهضومة متبوعة بخطوة إثراء مغناطيسي عامة للخلايا التائية وتلطيخ رباعي لتحليل التدفق الخلوي وفرزه. تستخدم الخطوات الموضحة في هذا البروتوكول تقنيات شائعة وكواشف متاحة بسهولة ، مما يجعلها في متناول أي باحث تقريبا يشارك في علم مناعة الخلايا التائية للفأر ، وهي قابلة للتكيف بشكل كبير مع مجموعة متنوعة من التحليلات النهائية لأي مجموعة خلايا تائية منخفضة التردد خاصة بالمستضد موجودة داخل الرئتين.
Introduction
في قلب جهاز المناعة التكيفي تكمن قدرة الخلية التائية على التعرف على مولد ضد معين والاستجابة له. متى وأين تستجيب الخلية التائية لمستضدها المماثل يحدد توازن العدوى والمناعة الذاتية ، والتوازن والسرطان ، والصحة والمرض1. ويترتب على ذلك أن دراسة الخلايا التائية في سياق معين من المناعة يجب أن تركز على الخلايا ذات الخصوصية لمستضد ذي صلة ذات أهمية. من بين التطورات التكنولوجية التي عززت بشكل كبير القدرة على توصيف مجموعات الخلايا التائية الخاصة بالمستضد ، توجد multimers القابلة للذوبان الموسومة بالفلورسنت (عادة رباعيات) لجزيئات معقد التوافق النسيجي الرئيسي (MHC) من الفئة الأولى أو الفئة الثانية المعقدة إلى حواجز الببتيد المستضدية ، والمعروفة باسم “الببتيد: رباعي MHC”2،3،4،5. من خلال تمثيل الروابط الطبيعية لمستقبلات مستضد الخلايا التائية (TCRs) ، يوفر الببتيد: رباعي الفئة الأولى والفئة الثانية من MHC وسيلة لتحديد خلايا CD8 + و CD4 + T الخاصة بالمستضد مباشرة ، على التوالي ، ضمن الذخيرة الداخلية للخلايا التائية في الجهاز المناعي دون الحاجة إلى استجابة لتحفيز المستضد في الفحص. تمثل Tetramers نهجا أكثر أناقة لدراسة الخلايا التائية الخاصة بالمستضد من نماذج النقل بالتبني للخلايا التائية المعدلة وراثياTCR 6 ، وقد تم استخدامها بشكل متزايد لتحديد مجموعات الخلايا التائية الأجنبية والذاتية الخاصة بالمستضد في كل من نماذج الفئران التجريبية والأمراض البشرية 4,5.
في حين أن tetramers يمكن بسهولة تحديد المجموعات عالية التردد من الخلايا التائية التي توسعت استجابة لتحفيز المستضد ، فإن استخدامها للخلايا التائية الساذجة أو الخاصة بالمستضد الذاتي أو الذاكرة محدود بسبب الترددات المنخفضة جدا لهذه المجموعات7. قامت مجموعتنا وغيرها بتطوير ونشر استراتيجيات التخصيب المغناطيسي القائمة على رباعي الرباعي التي تزيد من حساسية الكشف لتمكين دراسات مجموعات الخلايا هذه في الأنسجة اللمفاوية للفأر8،9،10،11.
أدى ظهور الخلايا التائية المقيمة في الأنسجة في هذا المجال إلى زيادة التركيز على تطوير طرق جديدة لدراسة الخلايا التائية في الفضاء غير اللمفاوي. مثل العديد من الأسطح المخاطية الأخرى ، تواجه الخلايا التائية في الرئتين مجموعة من المستضدات الذاتية والأجنبية المشتقة من ظهارة المضيف ، والميكروبات المتعايشة والمعدية ، والكيانات البيئية ، بما في ذلك المواد المسببة للحساسية. يوضح التحليل النسخي للخلايا التائية التي يتم حصادها من الأنسجة غير اللمفاوية (NLT) نمطا ظاهريا يشبه الذاكرة يحمل مصيرا ووظيفة فريدة خاصة بالأنسجة ، وغالبا ما يتم توجيهه إلى الاتجار وتوازن الأنسجة12. علاوة على ذلك ، تميل الخلايا التائية للذاكرة المقيمة في الأنسجة (Trms) إلى أن تكون أكثر تقييدا من تلك الموجودة في الدورةالدموية 13. يعد تحديد كيف ولماذا تدفع المستضدات إقامة الخلايا التائية في NLT أمرا بالغ الأهمية لفهم كيفية حماية الجهاز المناعي من العدوى ، والحفاظ على توازن الأنسجة ، وفي بعض الأحيان ، يتحول إلى مناعة ذاتية. ومع ذلك ، يبدو أن هناك استنزاف أكبر بين الخلايا التائية المقيمة في الأنسجة من الرئتين مقارنة ب NLT14 الأخرى. وفقا لذلك ، فإن القدرة على تحديد وتوصيف الخلايا التائية الداخلية للرئة مع خصوصية مستضد معينة محدودة بسبب ندرتها المتأصلة.
من خلال الجمع بين استخدام تقنيات إثراء الخلايا القائمة على الخرزة المغناطيسية والببتيد: تلطيخ رباعي MHC ، نجحنا في اكتشاف الخلايا التائية الموسعة ولكن النادرة الخاصة بالمستضد الذاتي في رئتي الفأر15,16. نقدم هنا وصفا تفصيليا لبروتوكول قمنا بتحسينه لعزل وتوصيف أي مجموعة نادرة من الخلايا التائية الخاصة بمولد الضد موجودة في رئتي الفأر بشكل موثوق (الشكل 1). يتضمن هذا البروتوكول خطوة تلطيخ الأجسام المضادة في الجسم الحي لتمييز الأنسجة المقيمة عن الخلايا التائية الوعائية17 متبوعة بطريقتين مختلفتين لمعالجة أنسجة الرئة لاستيعاب توافر الموارد. ثم يتبع ذلك خطوة عامة للتخصيب المغناطيسي للخلايا التائية ، وتلطيخ رباعي ، وتحليل عن طريق قياس التدفق الخلوي. يتم تعزيز صلاحية الخلية وتلطيخ رباعي في هذا البروتوكول عن طريق إضافة أمينوجوانيدين ، الذي يمنع سينسيز أكسيد النيتريك المستحث (iNOS) بوساطة موت الخلايا التائيةالناجم عن موت الخلايا المبرمج 18 و Dasatinib الذي يحد من تخفيض TCR19. تستخدم الخطوات الموضحة في هذا البروتوكول تقنيات شائعة وكواشف متاحة بسهولة ، مما يجعلها في متناول أي باحث تقريبا يشارك في علم مناعة الخلايا التائية للفأر وقابلة للتكيف بدرجة كبيرة لمجموعة متنوعة من التحليلات النهائية. على الرغم من أنه من غير المحتمل العثور على الخلايا التائية الساذجة في الرئتين، فإننا نعتقد أن هذا البروتوكول سيكون مفيدا بشكل خاص لدراسة الخلايا التائية الخاصة بمولد الضد الذاتي و Trms في الرئتين.
الشكل 1: نظرة عامة على سير عمل البروتوكول. يتم حصاد الرئتين من الفئران وفصلها إلى خلايا مفردة. يتم إثراء العينات لاحقا للخلايا التائية قبل تلطيخها بالببتيد: رباعيات MHC والأجسام المضادة ذات العلامات الفلورية لتحليل التدفق الخلوي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Protocol
Representative Results
Discussion
استفادت التوصيفات السابقة للخلايا التائية الخاصة بالمستضد من الرئتين من الأعداد القوية للخلايا التائية الخاصة بالمستضد والتي تتوسع بعد حدث فتيلة حاد مثل التحصين داخل الأنف أو العدوى20،21،22. ومع ذلك ، يصعب اكتشاف مجموعات الخلايا التائية ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر L. Kuhn على المساعدة الفنية في معالجة الأنسجة وإنتاج tetramer. تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R01 AI107020 و P01 AI165072 إلى JM ، T32 AI007512 إلى D.S.S.) ، واتحاد ماساتشوستس حول الاستعداد لمسببات الأمراض (JJM) ، واللجنة التنفيذية للأبحاث في مستشفى ماساتشوستس العام (JM).
Materials
| 100 mm cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
| 10x PBS without Ca++ or Mg++ | Corning | 46-013-CM | |
| 1x PBS without Ca++ or Mg++ | Corning | 21-031-CV | |
| AccuCheck Counting Beads | Invitrogen | PCB100 | |
| Aminoguanidine Hemisulfate Salt | Sigma-Aldrich | A7009 | |
| CD90.2 microbeads, mouse | Miltenyi | 130-121-278 | |
| Cell separation magnet (MidiMACS Separator) | Miltenyi | 130-042-302 | Holds single LS column |
| Cell separation magnet (QuadroMACS Separator) | Miltenyi | 130-090-976 | Holds 4 LS columns |
| Dasatinib | Sigma-Aldrich | CDS023389 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Eagle’s Ham’s Amino Acids medium | Sigma-Aldrich | C5572 | |
| gentleMACS | Miltenyi | 130-093-235 | Automated tissue dissociator |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi | 130-093-237 | Automated tissue dissociator tubes |
| Hank's Balanced Salt Solution with Ca++ or Mg++ | Corning | 21-020-CM | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| Ketamine | Vedco | NDC 50989-996-06 | |
| Liberase TM | Roche | 5401119001 | |
| Pacific Blue anti-mouse CD45 antibody (Clone: 30-F11) | Biolegend | 103126 | |
| Paramagnetic cell separation columns (LS Columns) | Miltenyi | 130-042-401 | Comes with plunger |
| Purified anti mouse CD16/32 antibody (Clone: 93) | Biolegend | 101302 | |
| RPMI 1640 medium without L-glutamine | Corning | 15-040-CM | |
| Sodium Chloride 0.9% (Normal Saline) | Cytiva | Z1376 | |
| Xylazine | Pivetal | NDC 466066-750-02 |
References
- Sun, L., Su, Y., Jiao, A., Wang, X., Zhang, B. T cells in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235 (2023).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Crawford, F., Kozono, H., White, J., Marrack, P., Kappler, J. Detection of antigen-specific T cells with multivalent soluble class II MHC covalent peptide complexes. Immunity. 8 (6), 675-682 (1998).
- Nepom, G. T., et al. HLA class II tetramers: tools for direct analysis of antigen-specific CD4 + T cells. Arthritis Rheum. 46 (1), 5-12 (2002).
- Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis. Nat Rev Immunol. 11 (8), 551-558 (2011).
- Moon, J. J., et al. Tracking epitope-specific T cells. Nat Protoc. 4 (4), 565-581 (2009).
- Jenkins, M. K., Moon, J. J. The role of naive T cell precursor frequency and recruitment in dictating immune response magnitude. J Immunol. 188 (9), 4135-4140 (2012).
- Moon, J. J., et al. Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27 (2), 203-213 (2007).
- Obar, J. J., Khanna, K. M., Lefrancois, L. Endogenous naive CD8+ T cell precursor frequency regulates primary and memory responses to infection. Immunity. 28 (6), 859-869 (2008).
- Kotturi, M. F., et al. Naive precursor frequencies and MHC binding rather than the degree of epitope diversity shape CD8+ T cell immunodominance. J Immunol. 181 (3), 2124-2133 (2008).
- Legoux, F. P., Moon, J. J. Peptide:MHC tetramer-based enrichment of epitope-specific T cells. J Vis Exp. 68, 4420 (2012).
- Szabo, P. A., Miron, M., Farber, D. L. Location, location, location: Tissue resident memory T cells in mice and humans. Sci Immunol. 4 (34), eaas9673 (2019).
- Poon, M. M. L., et al. Tissue adaptation and clonal segregation of human memory T cells in barrier sites. Nat Immunol. 24 (2), 309-319 (2023).
- Wakim, M. Z. M., Zheng, L. M. Tissue resident memory T cells in the respiratory tract. Mucosal Immunol. 15 (3), 379-388 (2022).
- Legoux, F. P., et al. CD4+ T cell tolerance to tissue-restricted self antigens is mediated by antigen-specific regulatory T Cells rather than deletion. Immunity. 43 (5), 896-908 (2015).
- Shin, D. S., et al. Lung injury induces a polarized immune response by self-antigen-specific CD4(+) Foxp3(+) regulatory T cells. Cell Rep. 42 (8), 112839 (2023).
- Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nat Protoc. 9 (1), 209-222 (2014).
- Vig, M., et al. Inducible nitric oxide synthase in T cells regulates T cell death and immune memory. J Clin Invest. 113 (12), 1734-1742 (2004).
- Lissina, A., et al. Protein kinase inhibitors substantially improve the physical detection of T-cells with peptide-MHC tetramers. J Immunol Methods. 340 (1), 11-24 (2009).
- Hogan, R. J., et al. Protection from respiratory virus infections can be mediated by antigen-specific CD4(+) T cells that persist in the lungs. J Exp Med. 193 (8), 981-986 (2001).
- Hogan, R. J., et al. Activated antigen-specific CD8+ T cells persist in the lungs following recovery from respiratory virus infections. J Immunol. 166 (3), 1813-1822 (2001).
- Zhao, J., et al. Airway memory CD4(+) T cells mediate protective immunity against emerging respiratory coronaviruses. Immunity. 44 (6), 1379-1391 (2016).
- Hondowicz, B. D., et al. Interleukin-2-dependent allergen-specific tissue-resident memory cells drive asthma. Immunity. 44 (1), 155-166 (2016).
- Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator. J Vis Exp. 29, 1266 (2009).
- Faustino, L. D., et al. Interleukin-33 activates regulatory T cells to suppress innate gammadelta T cell responses in the lung. Nat Immunol. 21 (11), 1371-1383 (2020).
- Atif, S. M., Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. Isolation and identification of interstitial macrophages from the lungs using different digestion enzymes and staining strategies. Methods Mol Biol. 1784, 69-76 (2018).
- Pape, K. A., Taylor, J. J., Maul, R. W., Gearhart, P. J., Jenkins, M. K. Different B cell populations mediate early and late memory during an endogenous immune response. Science. 331 (6021), 1203-1207 (2011).
- Naeher, D., et al. A constant affinity threshold for T cell tolerance. J Exp Med. 204 (11), 2553-2559 (2007).
- Moon, J. J., et al. Quantitative impact of thymic selection on Foxp3+ and Foxp3- subsets of self-peptide/MHC class II-specific CD4+ T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (35), 14602-14607 (2011).
- Koehli, S., Naeher, D., Galati-Fournier, V., Zehn, D., Palmer, E. Optimal T-cell receptor affinity for inducing autoimmunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (48), 17248-17253 (2014).
- Zhang, Z., Legoux, F. P., Vaughan, S. W., Moon, J. J. Opposing peripheral fates of tissue-restricted self antigen-specific conventional and regulatory CD4(+) T cells. Eur J Immunol. 50 (1), 63-72 (2020).
