מודל כירורגי לצינורות שופתן מהונדסים רקמה חד-שלבית במיני-חזירים
Summary
שתלים מהונדסים רקמות לניתוחי שחזור מתקדמים רק לעתים רחוקות מעבר לניסויים פרה-קליניים בשל תרבית אקס ויוו מייגעת, הכוללת רכיבי פיגומים מורכבים ויקרים. כאן, אנו מציגים הליך חד שלבי המיועד להטיית שתן עם פיגום צינורי נגיש על בסיס קולגן המכיל מיקרושתלים אוטולוגיים.
Abstract
ניתוחי שחזור מאותגרים לעתים קרובות על ידי מחסור ברקמת השתלה. בטיפול במומים בדרכי השתן, הפתרון הקונבנציונלי היה קצירת רקמת מערכת העיכול לשחזור לא אורתוטופי בשל השפע שלה כדי להחזיר תפקוד תקין אצל המטופל. התוצאות הקליניות לאחר סידור מחדש של רקמות טבעיות בגוף קשורות לעיתים קרובות לתחלואה משמעותית; לפיכך, הנדסת רקמות טומנת בחובה פוטנציאל ספציפי בתחום זה של ניתוח. למרות התקדמות משמעותית, פיגומים מהונדסים רקמות עדיין לא נקבעו כחלופה טיפולית כירורגית תקפה, בעיקר בשל הדרישות היקרות והמורכבות של חומרים, ייצור והשתלה. בפרוטוקול זה, אנו מציגים פיגום צינורי פשוט ונגיש מבוסס קולגן המשובץ בחלקיקי רקמה אוטולוגיים ספציפיים לאיברים, המיועד כצינור להסטת שתן. הפיגום נבנה במהלך ההליך הכירורגי הראשוני, מורכב מחומרי ניתוח נפוצים ודורש מיומנויות כירורגיות קונבנציונליות. שנית, הפרוטוקול מתאר מודל של בעלי חיים שנועד להעריך את התוצאות קצרות הטווח in vivo לאחר ההשתלה, עם אפשרות לווריאציות נוספות להליך. פרסום זה נועד להדגים את ההליך צעד אחר צעד, עם תשומת לב מיוחדת לשימוש ברקמה אוטולוגית וצורה צינורית.
Introduction
במומים בדרכי השתן, ניתוח שחזור יכול להידרש כדי לשחזר את האנטומיה התפקודית, לעתים קרובות על אינדיקציה חיונית 1,2. גישות כירורגיות קונבנציונליות השתמשו ברקמות טבעיות ממערכות איברים אחרות (כגון מערכת העיכול) כדי לשחזר את האיברים הפגומים או החסרים; עם זאת, לעתים קרובות עם הסיכון של סיבוכים חמורים לאחר הניתוח 3,4. במקרה של הטיית שתן עבור חולים עם תפקוד נוירוגני של שלפוחית השתן הזקוקים לצנתור ארוך טווח, התוספתן או מקטעי המעי הדק המותאמים מחדש משמשים לעתים קרובות לבניית צינור שתן 5,6. הנדסת רקמות מציעה רקמת השתלה חלופית הניתנת להתאמה למאפיינים ספציפיים לאיברים, ובכך למזער את התחלואה לאחר הניתוח עבור החולים 7,8. בעוד שפיגומים מסוגים שונים ניתנים להשתלה בכוחות עצמם, תאי פיגומים נוספים, רצוי עם תאים אוטולוגיים, הוכחו כמשפרים את תוצאות ההתחדשות לאחר ההשתלה 9,10,11,12,13,14. עם זאת, פיגומים מהונדסים רקמות מורכבים לעתים קרובות מרכיבים מורכבים ויקרים, ושנית, הדרישות לגידול תאים ex vivo וזריעת פיגומים הן מייגעות ועתירות משאבים. גורמים אלה עיכבו את התרגום הקליני של פיגומים מהונדסים רקמות, למרות כמה עשורים של מחקר בתחום. על ידי הפחתת המורכבות, כמו גם דרישות כספיות וחומרניות, פיגומים מהונדסים רקמות יכולים להיות מיושמים בניתוחים מודרניים בקנה מידה רחב, תוך התייחסות לפרוצדורות נדירות ונפוצות יותר.
קולגן הוכח בעבר כפלטפורמה בת קיימא להרחבת תאים, ויתר על כן, פועל כדבק ביולוגי חיובי בעת חיבור תאים או רקמות על פיגום להשתלה כירורגית 15,16,17. מיקרו-השתלה אוטולוגית פריאופרטיבית עוקפת את הצורך בתרבית תאי ex vivo על ידי קצירת הרקמה המעניינת במהלך ההליך הראשוני והשתלתה מחדש ישירות. על ידי טחינת הרקמה המנותחת לחלקיקים קטנים יותר, שטח הפנים ופוטנציאל הצמיחה גדלים, מה שמאפשר יחס התפשטות גדול יותר על הפיגום18. הפיגום המבוסס על קולגן אינו נצמד באופן ספציפי לשחזורי דרכי השתן, אך תיאורטית יכול לחול על אזורים רבים של שחזור איברים חלולים.
בכתב יד זה, אנו מציגים הן פרוטוקול לבניית פיגום צינורי, המשלב קולגן עם מיקרו-שתלים אוטולוגיים אוטולוגיים משובצים, והן מודל מיני-חזיר המעריך את ההיתכנות הטכנית והבטיחות, כמו גם את הביצועים הרגנרטיביים, של הפיגום in vivo. המודל הוערך ב-10 נקבות מיני-חזירות בוגרות באמצעות הפרוטוקול והשיטה המוצגים כאן. היתרון העיקרי של הפיגום הוא פשטות המבנה וההשתלה החד שלבית, החוסך מהמטופל מספר הליכים כירורגיים עוקבים. ההליך יכול להתבצע במסגרות כירורגיות קונבנציונליות על ידי צוות כירורגי רגיל ודורש ציוד וחומרים סטנדרטיים. המודל החייתי מאפשר סביבה מבוקרת לחקר ההשתלה בעוד בעל החיים חוזר בקלות להתנהגות רגילה, עם אפשרות נוספת ליישום וריאציות לפיגום ולהליך.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מציג טכניקה פשוטה ונגישה לניתוחי שחזור עתידיים. חסרון נפוץ בהנדסת רקמות, כולל הרחבת תאים אוטולוגית, הוא שלבי ההכנה היקרים והמשמעותיים הנדרשים לפני השתלה כירורגית. מיקרו-השתלה אוטולוגית עשויה לפשט רבים משלבים אלה ולאפשר הליכים חד-שלביים. על ידי השתלה אוטומטית של ישויות היסטולוגיות מורכבות, איתות פרקריני פרו-רגנרטיבי מושרה18. במחקרים קודמים חווינו שמיקרו-שתלים לבדם פגיעים לסביבה הפיזית, אלא אם כן הם מחוברים כראוי לפיגום15,19. קולגן נחקר כסביבה בת קיימא להרחבת רקמות במבחנה, והוא נבחר למטרה שלנו בזכות התאימות הביולוגית החיובית שלו והזמינות המסחרית שלו. הפיגום המרוכב המוצג כאן עבר אופטימיזציה בעבר במהלך ניסויים במבחנה שהעריכו שינויים בהטבעה של מיקרו-שתלים ובריכוזי קולגן 20,21,22. לפני בדיקות in vivo, תכונות הפיגום לגבי חדירות, ביומכניקה והשפלה הוערכו במבחנה20. יתר על כן, הרחבת רקמות מבוססות פיגומים in vivo אומתה בעבר בדגמי מכרסמים וארנבים21,22.
המודל הניתוחי נבחר כדי להעריך גרסה צינורית של הפיגומים, המחקה את ההגדרה הקלינית של הטיית שתן לתפקוד לקוי נוירוגני של שלפוחית השתן בילדים או מתבגרים. השלבים הקריטיים כוללים דיסקציה מדויקת של המיקרו-שתלים ברירית ושמירה על סביבה לחה מרגע הכריתה ועד להטמעת הפיגומים. שלב קריטי נוסף כולל התמצקות הידרוג’ל נכונה; צנרת זהירה של הקולגן מבטיחה שלא ייווצרו בועות אוויר בתוך הג’ל, והגדרות טמפרטורה נכונות ותמיסות רכיבים מבטיחות שהג’ל יתמצק כראוי. כישלון בהשגת ג’ל מוצק יגביר את הסיכון לדלמינציה של קולגן ולהיפרדות מיקרו-שתל. עבור החלק הניתוחי, טיפול זהיר במהלך ההשתלה הוא חיוני כדי למנוע פגיעה micrografts עקב טראומה מכנית או דיסוציאציה. לפני סגירת הבטן, פטנט נוזלים צריך להיות מטופל בזהירות על ידי insufflating שלפוחית השתן עם נוזלים.
מגבלות הטכניקה כוללות את עובי הפיגומים, אשר באופן אינטואיטיבי יש גבולות עליונים לגבי דיפוזיה של חומרי מזון מהסביבה החיצונית אל micrografts. מצד שני, ירידה בעובי הפיגום עלולה להוביל לחדירות גבוהה באופן בלתי הולם ולדליפת שתן. ההרכב הנוכחי שלנו מבוסס על הערכות מבחנה קודמות, שבהן הושווה20 לרגנרציה של תאים בריכוזי קולגן משתנים. מיקרו-השתלה של רקמות אוטולוגיות מסתמכת גם על רקמת שתל בריאה, מה שהופך את ההליך הנוכחי ללא מתאים למחלות ממאירות שבהן לא ניתן לשלול כראוי את הסיכון להשתלה חוזרת סרטנית23; עם זאת, הטכניקה הנוכחית נועדה למקרים עם ליקויים תפקודיים שבהם הדבר אינו נחשב לסיכון. למרות שהמודל מחקה מספר שלבים מההגדרה הקלינית (כלומר, הליך התוספתן), ניסוי זה אינו משתמש בסטומה מתפקדת במלואה להסטת שתן מכיוון שהצינור קשור באופן דיסטלי. כמו כן, מכיוון שסיבוכים קליניים יכולים להתרחש לכל החיים, תקופת תצפית של 6 שבועות עשויה לספק ידע מוגבל על תוצאות ספציפיות על מגבלות והמשכיות. לכן, ניתן להוסיף למחקר מעקב נוסף של 6 חודשים לאחר ניתוח הצינור שנרפא לרמת העור.
נקודת המבט של טכניקה זו מתייחסת לתכנון הפשוט, המאפשר יישומים אוניברסליים במקרה שמקור רקמת המיקרו-השתל והחומר הביולוגי התומך מוחלף בחלופות רלוונטיות אחרות. ניתן לשנות רכיבים אלה כך שיתאימו למטרות ספציפיות לאיברים הקשורים לחוזק פיגומים, גמישות ופירוק ביולוגי. לבסוף, ההוצאות הנגישות והזולות מאפשרות שחזור ותרגום מורחב של הטכניקה.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לצוות המחלקה לרפואה ניסויית (AEM), אוניברסיטת קופנהגן, על סיוע בתכנון וביצוע ניתוחים וגידול בעלי חיים, ול- ELLA-CS, s.r.o, Hradec Kralove, צ’כיה, על אספקת סטנטים מתכלים מותאמים אישית המשמשים במחקר. תמיכה כספית ניתנה על ידי האגודה השבדית למחקר רפואי, קרן Promobilia, קרן Rydbeck, קרן Samariten, הקרן לטיפול רפואי בילדים, קרן Frimurare Barnhuset בסטוקהולם וקרן נובו נורדיסק (NNFSA170030576).
Materials
| 10x MEM | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, US | 2517592 | Collagen preparation |
| 1x MEM | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, US | 2508924 | Collagen preparation |
| Ambu aScope 4 Cysto | Ambu A/S, Ballerup, DK | 1000682507 | Cystoscope |
| Aquaflush ACE stopper | Abena, Taastrup, DK | ACE12/220501 | ACE stopper |
| Borgal vet inj opl 200 + 40 mg/mL | Ceva Animal Health A/S | 510460 | Sulfonamide/Trimethoprim |
| Bupaq multidose vet 0.3 mg/mL | Salfarm Danmark A/S, DK | 502763 | Buprenorphin |
| Butomidor vet inj 10 mg/mL | Salfarm Danmark A/S, DK | 531943 | Buthorphanol |
| Comfortan vet inj 10 mg/mL | Dechra Veterinary Products A/S, DK | 492312 | Metadone |
| Ethilon suture 3-0 | Ethicon, Johnson & Johnson, New Brunswick, US | SGBCXV | Monofilament non-resorbable |
| Fentanyl inj 50 µg/mL(hamel) | Hameln Pharma ApS, DK | 432520 | Fentanyl |
| Ketador vet inj 100 mg/mL | Salfarm Danmark A/S, DK | 115727 | Ketamine |
| Metacam inj 20 mg/mL t.cattle/pig/horse | Boehringer Ingelheim Animal, DE | 6443 | Meloxcicam |
| Metacam oral suspension 15 mg/mL pigs | Boehringer Ingelheim Animal, DE | 482780 | Meloxcicam |
| Omnipaque | GF Healthcare, Oslo, NO | 16173849 | Contrast for CT |
| Pancytokeratin CK-AE | DAKO Agilent, US | GA053 | Clone AE1/AE3 |
| PDS suture 3-0 | Ethicon, Johnson & Johnson, New Brunswick, US | SEMMTQ | Monofilament slow-resorbable |
| Prolene suture 4-0 | Ethicon, Johnson & Johnson, New Brunswick, US | PGH187 | Monofilament non-resorbable |
| Propolipid t.inj/inf 10 mg/mL | Fresenius Kabi, DK | 21636 | Propofol |
| Rat-tail collagen type I | First Link Ltd, Wolverhampton, UK | 60-30-810 | 2.06 mg/mL protein in 0.6% acetic acid |
| Suprim vet 20 + 100 mg (Solution for use in drinking water) | Dechra Veterinary Products A/S, DK | 33661 | Sulfonamide/Trimethoprim |
| SX-ELLA Degradable Biliary DV stent | ELLA-CS, Trebes, CZ | S23000056-01 | ø 6 mm x 60 mm |
| Vicryl mesh | Ethicon, Johnson & Johnson, New Brunswick, US | VM1208 | Mesh |
| Vicryl suture 4-0 | Ethicon, Johnson & Johnson, New Brunswick, US | SMBDGDR0 | Braided fast-resorbable |
| Xysol vet inj 20 mg/mL | ScanVet Animal Health A/S, DK | 54899 | Xylazine |
| Zoletil 50 vet plv/sol t.inj 25 + 25 mg/mL | Virbac Danmark A/S, DK | 568527 | Tiletamine and Zolazepam |
References
- Surer, I., Ferrer, F. A., Baker, L. A., Gearhart, J. P. Continent urinary diversion and the exstrophy-epispadias complex. J Urol. 169 (3), 1102-1105 (2003).
- Cranidis, A., Nestoridis, G. Bladder augmentation. Int Urogynecol J Pelvic Floor Dysfunct. 11 (1), 33-40 (2000).
- Atala, A., Bauer, S. B., Hendren, W. H., Retik, A. B. The effect of gastric augmentation on bladder function. J Urol. 149 (5), 1099-1102 (1993).
- Husmann, D. A. Mortality following augmentation cystoplasty: A transitional urologist’s viewpoint. J Pediatr Urol. 13 (4), 358-364 (2017).
- Mitrofanoff, P. Trans-appendicular continent cystostomy in the management of the neurogenic bladder. Chir Pediatr. 21 (4), 297-305 (1980).
- Leslie, B., Lorenzo, A. J., Moore, K., Farhat, W. A., Bägli, D. J., Pippi Salle, J. L. Long-term followup and time to event outcome analysis of continent catheterizable channels. J Urol. 185 (6), 2298-2302 (2011).
- Horst, M., Eberli, D., Gobet, R., Salemi, S. Tissue engineering in pediatric bladder reconstruction-The road to success. Front Pediatr. 7, 91 (2019).
- Ajalloueian, F., Lemon, G., Hilborn, J., Chronakis, I. S., Fossum, M. Bladder biomechanics and the use of scaffolds for regenerative medicine in the urinary bladder. Nat Rev Uro. 15 (3), 155-174 (2018).
- Dorin, R. P., Pohl, H. G., De Filippo, R. E., Yoo, J. J., Atala, A. Tubularized urethral replacement with unseeded matrices: what is the maximum distance for normal tissue regeneration. World J Uro. 26 (4), 323-326 (2008).
- El Kassaby, A. W., AbouShwareb, T., Atala, A. Randomized comparative study between buccal mucosal and acellular bladder matrix grafts in complex anterior urethral strictures. J Urol. 179 (4), 1432-1436 (2008).
- Casarin, M., et al. Porcine small intestinal submucosa (SIS) as a suitable scaffold for the creation of a tissue-engineered urinary conduit: Decellularization, biomechanical and biocompatibility characterization using new approaches. Int J Mol Sci. 23 (5), 2826 (2022).
- Casarin, M., et al. A novel hybrid membrane for urinary conduit substitutes based on small intestinal submucosa coupled with two synthetic polymers. J Funct Biomater. 13 (4), 222 (2022).
- Drewa, T. The artificial conduit for urinary diversion in rats: a preliminary study. Transplant Proc. 39 (5), 1647-1651 (2007).
- Liao, W., et al. Tissue-engineered tubular graft for urinary diversion after radical cystectomy in rabbits. J Surg Res. 182 (2), 185-191 (2013).
- Reinfeldt Engberg, G., Lundberg, J., Chamorro, C. I., Nordenskjöld, A., Fossum, M. Transplantation of autologous minced bladder mucosa for a one-step reconstruction of a tissue engineered bladder conduit. Biomed Res Int. 2013, 212734 (2013).
- Ajalloueian, F., Nikogeorgos, N., Ajalloueian, A., Fossum, M., Lee, S., Chronakis, I. S. Compressed collagen constructs with optimized mechanical properties and cell interactions for tissue engineering applications. Int J Biol Macromol. 108, 158-166 (2018).
- Chamorro, C. I., Zeiai, S., Engberg, G. R., Fossum, M. Minced tissue in compressed collagen: A cell-containing biotransplant for single-staged reconstructive repair. J Vis Exp. 108, 53061 (2016).
- Juul, N., et al. Insights into cellular behavior and micromolecular communication in urothelial micrografts. Sci Rep. 13 (1), 13589 (2023).
- Reinfeldt Engberg, G., Chamorro, C. I., Nordenskjöld, A., Fossum, M. Expansion of submucosal bladder wall tissue in vitro and in vivo. Biomed Res Int. 2016, 5415012 (2016).
- Juul, N., Ajalloueian, F., Willacy, O., Chamorro, C. I., Fossum, M. Advancing autologous urothelial micrografting and composite tubular grafts for future single-staged urogenital reconstructions. Sci Rep. 13 (1), 15584 (2023).
- Willacy, O., Juul, N., Taouzlak, L., Chamorro, C. I., Ajallouiean, F., Fossum, M. A perioperative layered autologous tissue expansion graft for hollow organ repair. Heliyon. 10 (3), e25275 (2024).
- Chamorro, C. I., et al. Exploring the concept of in vivo guided tissue engineering by a single-stage surgical procedure in a rodent model. Int J Mol Sci. 23 (20), 12703 (2022).
- Casarin, M., Morlacco, A., Dal Moro, F. Bladder substitution: The role of tissue engineering and biomaterials. Process. 9 (9), 1643 (2021).
.