Последовательная доставка аденоассоциированного вируса через инъекцию боковой хвостовой вены взрослым мышам

Все процедуры обращения с животными и инъекций были одобрены Комитетом по уходу за животными в NINDS. Все процедуры на животных проводились в соответствии с рекомендациями NINDS по уходу за животными и их использованию. 1. Прединъекционная подготовка Приготовление дозы AAVОпределите средний вес мышей, которым будет вводиться инъекция. Рассчитайте максимально допустимый объем инъекции в соответствии с рекомендациями учреждения по уходу за животными, как показано в уравнении (1). Максимальный объем инжекта обычно равен объему (μл)/весу мыши (г) (например, 10 μл/г).Максимальный объем инжектата (μл)/мышь = (максимальный объем инжекта (μл/г)) × (средний вес мыши (г)) (1)ПРИМЕЧАНИЕ: Расчет примера: Максимальный объем инжекта на мышь = 10 мкл/г × 20 г/мышь = 200 мкл/мышь Установите дозу векторного генома AAV (vg), которая должна доставляться на одну мышь.ПРИМЕЧАНИЕ: Это может быть одно и то же абсолютное значение для разных мышей (например, все мыши получают 1,5 ×10 12 vg, независимо от того, сколько весит каждая мышь). Или доза может быть в vg/kg, поэтому общее vg, которое должно быть введено на одну мышь, должно быть рассчитано для каждой мыши в соответствии с весом этой мыши в день инъекции.Если доза указана в vg/кг, взвесьте каждую мышь в день инъекции до приготовления дозы. Рассчитаем векторные геномы, которые должны быть доставлены для каждой мыши в соответствии с ее весом, используя уравнение (2):Векторные геномы, которые должны быть доставлены в конкретную мышь (vg) = Заданное значение vg/кг (vg/кг) × (2)ПРИМЕЧАНИЕ: Использование vg/kg в качестве единицы дозы вместо vg/mouse может быть более целесообразным в некоторых доклинических исследованиях для обеспечения достоверных сравнений между вводимыми дозами. Это связано с различиями в весе между самцами и самками мышей одного возраста или, возможно, между мышами одного пола. Используйте максимальный объем инъекции и дозу AAV (vg) для расчета объемов запасного AAV и стерильного фосфатно-солевого буфера (PBS), которые необходимы для приготовления требуемой дозы (см. уравнения (3-6)). Убедитесь, что вводимый объем равен или меньше допустимого максимального объема инъекции. Всегда готовьте объем для инъекции, который по крайней мере на 15 мкл больше объема, который будет вводиться, чтобы учесть ошибки пипетирования и мертвое пространство шприца.Концентрация инжекта (vg/μL) = (3)Общее количество векторных геномов AAV, которые должны быть добавлены для приготовления инъекции (vg) = Концентрация инжектата (vg/μл) × объеме, который должен быть приготовлен (μл) (4)Объем запаса AAV, который должен быть добавлен для приготовления инъекции) (μл) = (5)Объем PBS, который должен быть добавлен для приготовления инжекта (μл) = Объем, который должен быть приготовлен (μл) – Объем запаса AAV, который должен быть добавлен для приготовления инжекта (μл) (6)ПРИМЕЧАНИЕ: Пример расчета:6 ×10 13 вг/кг (доза) будет вводиться в 200 мкл/мышь (объем для инъекции) в мышь весом 25 г. Титр запасов AAV составляет 3,0 × 1013 (vg/мл)Векторные геномы, которые должны быть доставлены этой конкретной мыши (vg) = 6 ×10 13 (vg/кг) × = 1,5 × 1012 vg для этой мышиКонцентрация инжекта = = 7,5 × 109 (vg/μL)Общее количество векторных геномов AAV, которые должны быть добавлены для приготовления инъекции = 7,5 × 109 (vg/μL) × (200 (μL) + 15 (μL)) = 1,6125 × 1012 (vg)Объем запаса AAV, который должен быть добавлен для приготовления инъекции = = 53,75 (μл)Объем PBS, добавляемый для приготовления инъекции = 215 (μл) – 53,75 (μл) = 161,25 (μл) Процедура подготовки дозы AAVПРИМЕЧАНИЕ: В соответствии с рекомендациями учреждения по биобезопасности и СИЗ для работы с AAV, в автоклавной стерильной микроцентрифужной пробирке объемом 1,7 мл без РНКазы и ДНКазы приготовьте инъекцию AAV, используя запас AAV и стерильную PBS в соответствии с расчетами на шаге 1.1.3.3. Всегда держите стоковый AAV и впрыскиваемый AAV на льду. Используйте чистые микропипетки и новые коробки с наконечниками для микропипеток для обеспечения стерильности. Выбросьте кончики для микропипеток, загрязненные AAV, в соответствии с рекомендациями учреждения по обращению с отходами.Разморозьте стоковый AAV на льду.ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте размораживания и повторного замораживания запасов AAV. Либо заказывайте, либо приготовьте запас AAV в аликвотах объемом 100-200 μл, чтобы избежать избытка AAV после приготовления дозы, которую необходимо будет повторно заморозить. Подготовка станции впрыскаЧисткаОчистите рабочую зону 70% этанолом (EtOH). Продезинфицируйте рабочую зону с помощью бактерицидного, фунгицидного и вирулицидного реагента(ов). Очистите ограничитель трубки мыши водой с мылом. Настройка станционного инструментаПоместите чистую пустую коническую пробирку объемом 15 мл в держатель/штатив для пробирок. Установите приподнятую платформу, на которой будет размещен ограничитель для трубки мыши (рис. 1A, B). Поместите чистый ограничитель трубки мыши в рабочую зону. Если вы вводите мышам, размер которых намного меньше доступного ограничителя мышиной трубки, используйте пластиковый конус для защиты от грызунов, чтобы сделать удерживающую втулку. Смотрите шаги 2.1.3-4. Поместите шприцы, которые будут использоваться для инъекций, в рабочую зону. Используйте инсулиновые шприцы объемом 0,3 мл с иглами 29 G. Разместите контейнер для отходов как можно ближе к станции впрыска, чтобы обеспечить немедленную утилизацию инструментов, загрязненных AAV. Потяните и нажмите на поршень каждого шприца несколько раз, чтобы убедиться, что поршень движется плавно, чтобы во время инъекции не было сопротивления, вызванного шприцем. Если поршень движется не плавно, выбросьте этот шприц и замените его новым. Рядом с местом инъекции должны быть весы для мыши и мини-центрифуга. Подготовьте AAV на льду в зоне инъекций. Подготовьте теплую воду (38-40 °C). Следите за тем, чтобы температура воды не превышала 40 °C, чтобы не вызвать ожоги хвоста мыши. 2. Процедура инъекции Сдерживание мышиВзвесьте каждую мышь, чтобы при необходимости рассчитать дозу в vg/кг. Убедитесь, что мышь полностью ограничена и не может двигаться.ПРИМЕЧАНИЕ: Если мышь не полностью удерживается, она может двигаться во время внутривенного введения, что приведет к смещению иглы. Это может привести к тому, что игла выйдет из вены и/или поранит мышь. Для ограничителя трубки:Промойте ограничитель теплой водой с мылом между мышами, чтобы очистить и прогреть держатель. Держите мышь за хвост. Вставьте хвост мыши в верхнее отверстие трубки; Затем медленно втяните мышь в ограничитель трубки. Если размер ограничителя трубки подходит для размера мыши, поместите вилку впереди мыши, чтобы предотвратить побег мыши.ПРИМЕЧАНИЕ: Вилка должна находиться достаточно близко к мыши, чтобы предотвратить ее движение или вращение внутри трубки, но вилка не должна закрывать нос мыши, чтобы мышь могла свободно дышать. Если размер мыши меньше размера ограничителя трубки, используйте гибкий одноразовый конус ограничителя в дополнение к ограничителю трубки, как описано ниже в шаге 2.1.4. Для гибких одноразовых удерживающих конусов при необходимости (чтобы сделать удерживающий рукав для маленьких мышей):Сделайте надрез на носовом конце конуса, чтобы нос мыши не был закрыт и у мыши было достаточно места для дыхания. Обрежьте заднюю часть конуса так, чтобы конус был почти такой же длины, как мышь (чтобы конус поместился внутри трубки) (рис. 1A, B). Поместите мышь в ограничитель трубки, как описано выше в шагах 2.1.3. Удерживая хвост мыши, вставьте конус удерживателя более широкой открывающейся стороной сначала в трубку. Держа мышь за хвост, дайте ей войти в конус; Затем вставьте оставшуюся часть конуса в трубку. Убедитесь, что хвост мыши полностью выходит из задней части трубки, и у мыши есть место для дыхания внутри конуса. Закрепите заглушку трубки непосредственно перед отверстием в носу конуса, убедившись, что мышь полностью зафиксирована и у нее достаточно места для дыхания. Внедрение мышиНаполните коническую трубку объемом 15 мл теплой водой. Поместите ограничитель трубки вместе с мышью внутри него на возвышенную платформу (рисунок 1B). Опустите как можно больше хвоста мыши в теплую воду не менее чем на 1 минуту, пока боковые вены не станут четко расширены и не станут видны (рисунок 1B). На этапе подогрева хвоста загрузите дозу AAV в шприц.Поместите незакрытую микроцентрифужную пробирку объемом 1,7 мл, содержащую AAV, в штатив для пробирок. Вставьте иглу вертикально в трубку доминирующей рукой. Как только игла окажется внутри трубки, удерживайте трубку недоминирующей рукой.ПРИМЕЧАНИЕ: Вертикальное введение иглы предотвращает повреждение иглы, которое может быть вызвано прикосновением к стенке трубки. Можно использовать и другие альтернативные методы загрузки шприца, но при этом должна быть обеспечена безопасность экспериментатора и инъекционной мыши. Удержание трубки недоминирующей рукой защищает от случайных травм от прокола иглы, если игла вводится во время удержания трубки. Когда игла находится внутри трубки, поднимите трубку и шприц одновременно на уровень глаз, следя за тем, чтобы игла не касалась стенки трубки. Положите обе руки на стол, чтобы стабилизировать их. Медленно наберите дозу в шприц.ПРИМЕЧАНИЕ: Медленная аспирация предотвращает прикрепление мелких пузырьков воздуха к стенкам цилиндра шприца. Изгоните пузырьки воздуха из шприца. При введении AAV убедитесь, что пузырьки воздуха выводятся из шприца через одноразовую абсорбирующую прокладку, которая будет утилизирована в коробке для биологически опасных веществ. Удерживайте инъекцию не менее 40 с, чтобы она прогрелась.ПРИМЕЧАНИЕ: Перед инъекцией всегда следите за тем, чтобы инъекция была теплой. При введении холодного инъекта инъекция может не протекать через вену, за исключением первых нескольких литров. Проверяйте вены хвоста каждую минуту.ПРИМЕЧАНИЕ: Вены должны быть ОЧЕНЬ заметными на всем пути до места инъекции (добавьте время для прогрева хвоста и замените свежей теплой водой по мере необходимости, пока вена не станет четко видимой, но не превышайте время удержания мыши, разрешенное протоколом обращения с животными учреждения). Убедившись, что вены хорошо видны, снимите ограничитель трубки с верхней части приподнятой платформы и положите ограничитель трубки прямо на стол. Расположите мышь в ограничителе ногами вниз, а не в сторону, чтобы облегчить работу с хвостом.ПРИМЕЧАНИЕ: Мышь не должна лежать на боку или спиной внутри ограничителя. Мышь должна быть полностью зафиксирована и не должна перемещаться или вращаться внутри ограничителя или двигать/тянуть его хвост. Быстро протрите хвост марлей, чтобы он высох; Протрите хвост спиртовым тампоном, а затем вытрите его насухо сухой марлей.ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте сухую марлю, чтобы хвост был достаточно сухим, чтобы обеспечить надежное сцепление с хвостом, но не полностью сухим. Увидеть вену может быть сложнее, когда хвост полностью сухой. Поверните хвост примерно на 90° влево или вправо так, чтобы одна из двух боковых жилок была обращена вверх. Найдите подходящее место для инъекции в средней трети хвоста. Начинайте первоначальную инъекцию дистально (ближе к кончику хвоста) и двигайтесь проксимально, если дополнительные инъекции требуются из-за неудачных попыток или по экспериментальному плану.ПРИМЕЧАНИЕ: Не пытайтесь делать инъекцию дистальнее места предыдущей инъекции, так как инъекция может вытекать из этого предыдущего места инъекции. Необязательно: с помощью большого и указательного пальцев недоминирующей руки надавите проксимально (вверх/ближе к телу мыши) на место инъекции в течение 10 с. Пальцы действуют как жгуты для дальнейшего расширения вены в месте инъекции. Сразу после 10 с жгута отпустите пальцы жгута и убедитесь, что одна из двух боковых вен обращена вверх и хорошо видна. Удерживайте хвост недоминантной рукой с помощью большого и указательного пальцев непосредственно дистальнее места инъекции. Загните хвост на указательный палец так, чтобы место инъекции лежало ровно на указательном пальце. Потяните хвост назад так, чтобы хвост был растянут, а место инъекции было полностью горизонтально (под углом 0°) (параллельно горизонтальному столу) (рисунок 1C). Удерживайте шприц указательным и средним пальцами доминирующей руки по обе стороны от фланца цилиндра шприца, держа большой палец наготове у поршня.ПРИМЕЧАНИЕ: Это облегчит перемещение большого пальца или иглы, когда игла находится внутри вены (Рисунок 1C). Положите обе руки на стол, чтобы стабилизировать их, и положите иглу прямо на хвост и вену параллельно им, а фаска направлена вверх. Держите место инъекции близко к указательному пальцу, держащему хвост, чтобы улучшить контроль и стабильность места инъекции.ПРИМЕЧАНИЕ: Ограничитель трубки должен быть достаточно глубоко в столе, чтобы обе руки опирались на стол. Держа иглу параллельно хвостовой вене и оказывая давление вниз на иглу, сдвиньте иглу вперед в вену.ПРИМЕЧАНИЕ: Давление вниз должно быть достаточным для введения иглы под правильным углом в вену. Вена крайне неглубокая, поэтому игла должна быть максимально плоской при попытке попасть в вену. Медленно вводите раствор в вену. После введения дозы медленно извлечь иглу и немедленно прижать марлю к месту инъекции не менее чем на 10 с, чтобы остановить кровотечение.ПРИМЕЧАНИЕ: Давите столько, сколько необходимо, пока кровотечение полностью не остановится, чтобы избежать потенциальной потери введенного реагента. После извлечения иглы обычно появляется капля крови, указывающая на то, что игла проникла в вену. Изредка капли крови не появляются даже при удачном уколе. Капля крови не свидетельствует об успешной инъекции; Она лишь указывает на то, что игла проникла в вену. Надежным показателем успешного впрыска является полное отсутствие сопротивления плунжера во время впрыска. Если игла находится внутри вены, во время инъекции не должно быть сопротивления в поршне иглы, и вена, расположенная ближе к месту инъекции, на мгновение будет казаться немного светлее по цвету (бледнеет) (у некоторых линий мышей побледнение вены может быть не очень четким). Если есть сопротивление и/или в месте инъекции начинает появляться выпуклость, значит, игла неправильно размещена внутри вены. В этом случае полностью удалите иглу из хвоста и попытайтесь ввести вену в новое место инъекции, расположенное проксимальнее места неудачной инъекции (ближе к телу мыши). Выбросьте шприцы и трубки, загрязненные AAV, в соответствии с инструкциями учреждения по обращению с отходами. Освободите мышь от ограничителей и поместите ее обратно в новую клетку, отдельную от неинъекционных мышей. Наблюдайте за мышами в течение 10 минут, чтобы обеспечить нормальный уровень активности после инъекции.ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволяет избежать потенциальной передачи инъекционных агентов неинъекционным мышам при введении трансмиссивных агентов. Продезинфицируйте рабочую зону с помощью бактерицидного, фунгицидного и вирулицидного реагента (реагентов) и 70% этида. Очистите ограничитель трубки мыши водой с мылом. 3. Диссекция, забор и фиксация тканей27 Подготовка станции забора тканейОчистите рабочую станцию реагентом для деградации ДНК в соответствии с инструкциями производителя, чтобы разрушить загрязняющую ДНК, которая может присутствовать в рабочей зоне. Поместите метилбутан в металлическую емкость. Поместите металлический контейнер с метилбутаном в коробку из пенополистирола; Затем окружите металлический контейнер сухим льдом так, чтобы уровень сухого льда вокруг контейнера был выше, чем уровень метилбутана внутри контейнера. Наклейте этикетку и положите на сухой лед пустые пробирки для хранения салфеток микроцентрифуги объемом 2 мл. Оставьте пробирки для хранения метилбутана и тканей остыть на сухом льду не менее чем на 20 минут, прежде чем начать замораживать ткани. Поместите щипцы для переноса тканей на сухой лед. Пометьте и наполните еще один набор микроцентрифужных пробирок для хранения тканей объемом 2 мл свежим 4% параформальдегидом (PFA) и храните их при комнатной температуре. Добавьте достаточное количество 4% PFA в каждую трубку, чтобы полностью погрузить ткани, которые будут помещены в трубку. Забор и фиксация тканейУсыпьте мышь в соответствии с рекомендациями учреждения по уходу за животными.ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мыши были усыплены с помощью шейного вывиха. Полностью распылите на мышь 70% EtOH. Соберите необходимые салфетки.ПРИМЕЧАНИЕ: Описанный здесь протокол сбора и фиксации был протестирован на скелетных мышцах и печени. Для тканей, которые будут использоваться для экстракции ДНК:Опустите ткань в предварительно охлажденный на сухом льду метилбутан и оставьте ткань в метилбутане не менее чем на 1 минуту. Используйте предварительно охлажденные передаточные щипцы для переноса замороженных тканей из метилбутана в предварительно охлажденные пустые микроцентрифужные пробирки для хранения тканей объемом 2 мл. Храните салфетку при температуре -80 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: Необязательно: Ткань можно разрезать на кусочки по 20 мг перед добавлением метилбутана, чтобы она была готова к использованию на шаге 4.1.4. Для тканей, которые будут использоваться для гистологического анализа и сохранения флуоресценции репортерных белков:С помощью щипцов, предназначенных для PFA, хранящихся при комнатной температуре, опустите ткани в соответствующую микроцентрифужную пробирку, содержащую 4% PFA (при комнатной температуре), убедившись, что ткань полностью погружена в 4% раствор PFA.ПРИМЕЧАНИЕ: Загрязнение PFA может негативно повлиять на различные молекулярные анализы, расположенные ниже по потоку. При работе с PFA используйте только щипцы, предназначенные для PFA, чтобы предотвратить загрязнение PFA других тканей или инструментов. Поместите микроцентрифужные пробирки на решетку и накройте ее фольгированной бумагой, чтобы пробирки оставались в темноте. Инкубируйте закрытую решетку при температуре 4 °C в шейкере с легким встряхиванием в течение ночи. После ночной инкубации приготовьте 5% сахарозы (% по массе) в 1x PBS, растворив 5,0 г сахарозы в 70 мл 1x PBS путем энергичного встряхивания. Добавьте достаточное количество PBS к конечному общему объему 100 мл для получения 5% раствора сахарозы (% по массе). Стерилизуйте 5% раствор сахарозы с помощью шприцевого фильтра 0,22 мкм. Пробирки для микроцентрифуг объемом 2,0 мл промаркируйте и наполните свежеприготовленной 5% сахарозой. Перенесите ткани из 4% PFA в соответствующую микроцентрифужную пробирку, содержащую 5% сахарозы (при комнатной температуре), убедившись, что ткань полностью погружена в 5% раствор сахарозы. Поместите микроцентрифужные пробирки на решетку и накройте ее фольгированной бумагой, чтобы пробирки оставались в темноте. Инкубируйте закрытую решетку при температуре 4 °C в шейкере с легким встряхиванием в течение ночи. После ночной инкубации приготовьте 20% сахарозы (% по массе) в 1x PBS, растворив 20,0 г сахарозы в 70 мл 1x PBS путем энергичного встряхивания. Добавьте достаточное количество PBS в 100 мл к конечному общему объему 100 мл, чтобы получить 20% раствор сахарозы (% по массе). 20% раствор сахарозы простерилизовать с помощью шприцевого фильтра 0,22 мкм. Маркируйте и заполняйте микроцентрифужные пробирки объемом 2,0 мл свежеприготовленной 20% сахарозой. Перенесите ткани из 5% сахарозы в соответствующую микроцентрифужную пробирку, содержащую 20% сахарозы (при комнатной температуре), убедившись, что ткань полностью погружена в 20% раствор сахарозы. Поместите микроцентрифужные пробирки на решетку и накройте ее фольгированной бумагой, чтобы пробирки оставались в темноте. Инкубируйте закрытую решетку при температуре 4 °C в шейкере с легким встряхиванием в течение ночи. После ночной инкубации поместите метилбутан в металлический контейнер и поместите металлический контейнер с метилбутаном в коробку из пенополистирола. Окружите металлический контейнер сухим льдом так, чтобы уровень сухого льда вокруг контейнера был выше, чем уровень метилбутана внутри контейнера. Наклейте этикетку и поместите пустые микроцентрифужные пробирки для хранения салфеток объемом 2 мл на сухой лед. Оставьте пробирки для хранения метилбутана и тканей остыть на сухом льду не менее чем на 20 минут, прежде чем начать замораживать ткани. Поместите пересадочные щипцы на сухой лед. Быстро промокните салфетки с помощью точных салфеток, чтобы удалить излишки 20% сахарозы. Опустите салфетку в предварительно охлажденный на сухом льду метилбутан. Оставьте салфетку в метилбутане не менее чем на 1 минуту. Используйте предварительно охлажденные передаточные щипцы для переноса замороженных тканей из метилбутана в предварительно охлажденные пустые микроцентрифужные пробирки для хранения тканей объемом 2 мл. Храните салфетку при температуре -80 °C. 4. dPCR для количественного определения vg/dg Экстракция ДНК из тканей и первичное расщепление РНКПРИМЕЧАНИЕ: Руководство по набору для экстракции ДНК, указанному в Таблице материалов , было использовано для получения этого протокола экстракции ДНК. Всегда держите пробирки с замороженными кусочками ткани на сухом льду.Приготовьте ведро со льдом. Для каждого образца ДНК пометьте одну пробирку для лизисных шариков объемом 1,5 мл и две пустые пробирки для микроцентрифуги объемом 1,7 мл без РНКазы и без ДНКазы. Добавьте 180 мкл первого буфера из набора для экстракции ДНК в каждую пробирку с шариками. Тарируйте первую шариковую трубку, содержащую буфер.ПРИМЕЧАНИЕ: Если ткани не были предварительно разрезаны на шаге 3.2.4.1, используйте лезвие бритвы, предварительно охлажденное на сухом льду, чтобы разрезать ткань на кусочки по 20 мг. Этот шаг должен быть выполнен в чистом криостате, хранящемся при температуре -20 °C или ниже. Добавьте в трубку один кусочек салфетки; Взвесьте и запишите вес ткани (должен быть ~20 мг.). Сразу же поместите на лед трубку для лизиса с находящейся в ней тканью. Буфер может кристаллизоваться. Повторите предыдущие шаги для каждого образца ткани. Переложите пробирки в блендер для лизирующих шариков и работайте 1 мин на максимальной скорости (скорость 10) при 4 °C. Поместите образцы на лед, чтобы перенести их в центрифугу. Центрифугируйте в течение 1 минуты при 20 000 × г при 4 °C. На этапе центрифугирования добавьте 20 мкл протеиназы К в первую серию микроцентрифужных пробирок объемом 1,7 мл. После этапа центрифугирования перенесите надосадочную жидкость гомогенатов в пробирки объемом 1,7 мл, содержащие протеиназу К, и хорошо перемешайте. Инкубировать при температуре 56 °C в течение 15 минут, перемешивая со скоростью 500 об/мин. Соберите капли со стенок и крышки пробирки, центрифугируя пробирку в течение 1-2 с с помощью мини-центрифуги. Выдерживать при комнатной температуре в течение 2 минут. Добавьте 4 мкл РНКазы А и перемешайте путем кратковременного импульсного вихревого перемешивания. Выдерживать при комнатной температуре в течение 2 минут. Импульсно-вихревой в течение 15 с. Соберите капли со стенок и крышки пробирки, центрифугируя пробирку в течение 1-2 с с помощью мини-центрифуги. Добавьте 200 мкл второго буфера из набора для экстракции ДНК. Импульсно-вихревой в течение 15 с. Соберите капли со стенок и крышки пробирки, центрифугируя пробирку в течение 1-2 с с помощью мини-центрифуги. Добавьте 200 μL 100% EtOH. Импульсно-вихревой в течение 15 с. Соберите капли со стенок и крышки пробирки, центрифугируя пробирку в течение 1-2 с с помощью мини-центрифуги. Перенесите лизаты в спиновую колонку для экстракции ДНК. Вращайте при 6 000 × g в течение 1 минуты. Поместите спиновую колонку в новую пробирку для сбора. Добавьте 500 мкл третьего буфера набора для экстракции ДНК в спиновую колонку. Вращайте при 6 000 × g в течение 1 минуты. Поместите спиновую колонку в новую пробирку для сбора. Добавьте 500 мкл четвертого буфера из набора для экстракции ДНК в спиновую колонку. Вращайте при 20 000 × g в течение 3 минут. Поместите спиновую колонку в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,7 мл. Добавьте в спиновую колонну 100 μл молекулярной воды. Выдерживать при комнатной температуре в течение 1 мин. Вращайте при 6 000 × г в течение 1 минуты при комнатной температуре. При необходимости измерьте концентрацию ДНК. Хранить при температуре 4 °C при кратковременном хранении или при температуре -20 °C при длительном хранении. Экстракция ДНК из клеток, отсортированных методом FACSПРИМЕЧАНИЕ: Руководство по набору для экстракции ДНК, указанному в Таблице материалов , было использовано для получения этого протокола экстракции ДНК.После сортировки ячеек центрифугируйте образцы при 300 × г в течение 5 с, чтобы собрать все капли с боков и крышки. Убедитесь, что все капли собраны.ПРИМЕЧАНИЕ: Если объем образца меньше 1,5 мл, переходите непосредственно к следующему шагу. Если объем образца превышает 1,5 мл, осторожно извлеките и выбросьте верхнюю часть надосадочной жидкости с помощью микропипетки, оставив 1-1,5 мл образца. Перемешайте образец, пипетируя вверх и вниз несколько раз, и переложите образец в микроцентрифужную пробирку объемом 1,7 мл. Центрифугировать при 515 × г в течение 1 мин при комнатной температуре. Выбросьте надосадочную жидкость, за исключением последних 50 мкл. Повторно суспендируйте гранулу в 50 мкл первого буфера набора для экстракции ДНК до конечного объема 100 мкл. Следуйте протоколу производителя по выделению геномной ДНК из небольших объемов крови (см. Таблицу материалов).Добавьте 10 мкл протеиназы К и 100 мкл второго буфера набора для экстракции ДНК; Перемешивание методом импульсно-вортексирования в течение 15 с. Инкубируйте образцы при температуре 56 °C в течение 10 минут при перемешивании со скоростью 300 об/мин. В течение этого инкубационного периода дважды перемешайте образцы путем мягкой инверсии. Соберите капли со стенок и крышки пробирки, центрифугируя пробирку в течение 1-2 с с помощью мини-центрифуги. Добавьте 50 μL 100% EtOH и перемешайте путем импульсного вихревого нагревания в течение 15 с. Инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 5 минут. Соберите капли со стенок и крышки пробирки, центрифугируя пробирку в течение 1-2 с с помощью мини-центрифуги. Перенесите образцы в колонку для экстракции ДНК (колонка находится в пробирке для сбора объемом 2 мл), не смачивая ободок. Центрифугируйте при 6 000 × г в течение 1 мин. Поместив колонку в чистую сборную пробирку объемом 2 мл, выбросьте сборную трубку, содержащую проточный проход. Добавьте в колонку 500 мкл буфера третьего набора для экстракции ДНК, не смачивая ободок, и центрифугируйте при 6000 × г в течение 1 мин. Опять же, поместив колонку в чистую сборную пробирку объемом 2 мл, выбросьте сборную трубку, содержащую проточный проход. Добавьте 500 мкл четвертого буфера набора для экстракции ДНК в колонку, не смачивая ободок, и центрифугируйте при 6000 × г в течение 1 мин. Поместите колонку в чистую пробирку для сбора объемом 2 мл и выбросьте проточную пробирку для сбора. Центрифугируйте при 20 000 × г в течение 3 мин. Поместите колонку в чистую микроцентрифужную пробирку объемом 1,7 мл и выбросьте проточную пробирку для сбора. Добавьте 20 μL молекулярной воды в центр мембраны колонны для элюирования; Закройте крышку и инкубируйте образцы с молекулярной водой комнатной температуры в течение 5 минут. Центрифугируйте при 20 000 × г в течение 1 мин. Храните элюированную ДНК при температуре 4 °C при кратковременном хранении или при -20 °C при длительном хранении. Расщепление и очистка РНКПРИМЕЧАНИЕ: Руководство по набору для извлечения ДНК, указанному в Таблице материалов , было использовано для получения этого протокола очистки ДНК. В зависимости от условий дПЦР, реагентов, а также конструкций праймеров и зондов, может потребоваться убедиться в полном отсутствии РНК в образце ДНК, прежде чем приступать к количественному определению vg/dg методом дПЦР. Контаминация РНК может привести к различной степени неточности значений vg/dg при определенных условиях дПЦР.В ПЦР-пробирку объемом 0,2 мл или микроцентрифужную пробирку объемом 1,7 мл добавьте не более 20 мкл экстрагированного образца ДНК и 1,5 мкл РНКазы, свободной от ДНКазы, к каждому образцу ДНК. Если объем смеси ДНК/РНКазы составляет менее 21,5 мкл, добавьте достаточное количество молекулярной воды до конечного объема 21,5 мкл и перемешайте 25 раз, перевернув пробирки. Инкубировать при температуре 37 °C в течение 30 минут с периодическим перемешиванием каждые 10 минут, переворачивая пробирки.ПРИМЕЧАНИЕ: Общее количество нуклеиновых кислот, добавляемых в пробирку, должно составлять от 175 нг до 700 нг. Модификации могут потребоваться, если образцы ДНК содержат объемы или количества нуклеиновых кислот за пределами этого диапазона или если образцы ДНК были выделены иначе. Выложите на лед на 2 минуты. Добавьте достаточное количество молекулярной воды в каждую смесь ДНК/РНКазы до конечного объема 100 μл.ПРИМЕЧАНИЕ: РНКаза, указанная здесь, рекомендуется, поскольку она переваривает загрязняющую РНК без негативного влияния на целевую ДНК или последующие ПЦР-анализы. Следуйте протоколу производителя по очистке геномной ДНК (см. Таблицу материалов).Добавьте 10 мкл первого буфера для экстракции ДНК и 250 мкл второго буфера для набора для экстракции ДНК. Перемешиваем импульсно-вихревым действием в течение 10 с. Перенесите образцы в колонку для экстракции ДНК в пробирке для сбора объемом 2 мл, не смачивая ободок. Центрифугируйте при 6 000 × г в течение 1 мин. Поместив колонку в чистую сборную пробирку объемом 2 мл, выбросьте сборную трубку, содержащую проточный проход. Добавьте в колонку 500 мкл второго буфера из набора для экстракции ДНК, не смачивая ободок. Центрифугируйте при 6 000 × г в течение 1 мин. Поместите колонку в чистую пробирку для сбора объемом 2 мл и выбросьте проточную пробирку для сбора. Центрифуга при 20 000 × г в течение 6 мин. Поместите колонку в чистую микроцентрифужную пробирку объемом 1,7 мл и выбросьте сборную трубку, в которой находится проточный проход. Добавьте 20 мкл молекулярной воды в центр мембраны колонки для элюирования, закройте крышку и инкубируйте образцы с молекулярной водой при комнатной температуре в течение 5 минут. Центрифугируйте при 20 000 × г в течение 1 мин. Хранить при температуре 4 °C при кратковременном хранении или при температуре -20 °C при длительном хранении. Подтвердите отсутствие контаминации РНК в расщепленном образце РНКазы с помощью конечной ПЦР или дПЦР или количественной ПЦР (кПЦР) с использованием пары праймеров ПЦР, которая амплифицирует область мРНК, охватывающую несколько экзонов, а не только один экзон.ПРИМЕЧАНИЕ: Мишень мРНК должна иметь ген с высокой экспрессией в ткани/типе клеток-мишени, чтобы гарантировать правильную идентификацию контаминации мРНК, если она присутствует. Ампликоны, охватывающие несколько экзонов, дифференцируют полосы, полученные в результате загрязнения мРНК и геномной ДНК. Всегда имейте при себе образец ДНК, не расщепленный РНКазой, в качестве положительного контроля для ПЦР-реакции, чтобы гарантировать обнаружение контаминации мРНК, если она присутствует. Цифровая ПЦР (дПЦР)ПЦР в конечной точке для проверки специфичности праймеров и оптимальных условий ПЦР (опционально)Разработка пар праймеров и зондов dPCR для векторного генома и пар праймеров dPCR и зондов для референсного гена мыши, которые будут использоваться для количественной оценки диплоидных геномов в образце.ПРИМЕЧАНИЕ: Стремитесь к размеру ампликона от 60 до 150.н. Референсный ген мыши должен быть геном, который имеет постоянное число копий гена на диплоидный геном. Для перечисленных здесь расчетов референсный ген (Polr2a) имеет две копии на диплоидный геном. Для ПЦР-реакции с конечной точкой объемом 10 мкл приготовьте смесь для ПЦР с использованием реагентов и конечных концентраций, которые будут использованы позже для реакции дПЦР. Добавьте расщепленный РНКазой образец матричной ДНК (количество нуклеиновых кислот в диапазоне 56-223 нг) до конечной концентрации 1x мастер-смеси dPCR, содержащей ДНК-полимеразу и dNTP, 0,8 мкМ каждого прямого праймера, 0,8 мкМ каждого обратного праймера, 0,4 мкМ каждого зонда и 0,025 Ед/мкл фермента рестрикции (конечная концентрация фермента рестрикции зависит от используемого фермента рестрикции и марки). Добавьте молекулярную воду до конечного объема 10 мкл.ПРИМЕЧАНИЕ: В смеси для ПЦР должно быть не менее двух пар праймеров и двух зондов: одна пара праймеров и один зонд для детектирования векторного генома и одна пара-праймер и один зонд для детектирования генома мыши. Условия термического циклирования ПЦР: начальная стадия тепловой активации при 95 °C в течение 2 мин, за которой следуют 35-45 циклов стадии денатурации при 95 °C в течение 25 с и комбинированная стадия отжига/удлинения при 58-62 °C в течение 1 мин.ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная температура отжига должна быть определена для каждой пары ампликона и праймера. Количество циклов может быть скорректировано в соответствии с количеством матричной ДНК в образце. Визуализируйте продукт ПЦР на агарозном геле с помощью гель-электрофореза для определения наличия целевых полос ампликона и любых возможных неспецифических полос амплификации. Переходите к следующему этапу дПЦР после подтверждения того, что пары праймеров и условия циклирования приводят к специфической амплификации целевых последовательностей. реакция дПЦРДля реакции дПЦР объемом 40 мкл добавьте до 4 мкл расщепленного РНКазой образца матричной ДНК (количество нуклеиновых кислот в диапазоне 50-330 нг) до конечной концентрации 1x мастер-смеси дПЦР, содержащей ДНК-полимеразу и дНТФ, 0,8 мкМ каждого прямого праймера, 0,8 мкМ каждого обратного праймера, 0,4 мкМ каждого зонда, и 0,025 Ед/мкл фермента рестрикции (конечная концентрация фермента рестрикции зависит от используемого фермента рестрикции и марки). Добавьте молекулярную воду до конечного объема 40 мкл. Условия термического циклирования dPCR: начальная стадия активации нагрева при 95 °C в течение 2 мин, за которой следуют 40-50 циклов стадии денатурации при 95 °C в течение 25 с и комбинированная стадия отжига/удлинения при 58-62 °C в течение 1 мин.ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная температура отжига должна быть определена для каждой пары ампликона и праймера. Количество циклов может быть скорректировано в соответствии с количеством матричной ДНК в образце. Объемы, концентрации и условия, перечисленные здесь, оптимизированы для планшетов, реагентов и устройств для дПЦР, перечисленных в Таблице материалов. Эти условия снижают действие любых потенциальных ингибиторов дПЦР, которые могут снизить точность реакции. После проведения реакции дПЦР и получения абсолютных значений векторных геномов и референсного гена мыши рассчитать vg/dg в образце с помощью уравнений (7-8).Для референсных генов с двумя копиями генов/диплоидным геномом:Абсолютное значение диплоидных геномов (dg) = (7)vg/dg = (8) Проверьте 1D-диаграмму рассеяния реакции dPCR, чтобы подтвердить достоверность анализа и количественной оценки (рис. 3A, C). Чтобы анализ был валидным, убедитесь, что 1D диаграмма рассеяния удовлетворяет всем следующим критериям: наличие положительных и отрицательных разбиений; четкое разделение между положительными и отрицательными разделами для точного определения пороговых значений; и отсутствие капель между положительным и отрицательным разделами (также известное как дождь), что может снизить точность количественного определения dPCR.