التوصيل المستمر للفيروس المرتبط بالغدي عن طريق حقن الوريد الجانبي في الفئران البالغة
1Neuromuscular and Neurogenetic Disorders of Childhood Section, National Institute of Neurological Disorders and Stroke,National Institutes of Health, 2The Dubowitz Neuromuscular Centre, Molecular Neurosciences Section, Developmental Neurosciences Research and Teaching Department, Great Ormond Street Institute of Child Health,University College London, 3Department of Molecular Microbiology and Immunology,University of Southern California, 4NIHR Great Ormond Street Hospital Biomedical Research Centre, 5Genetics and Genomic Medicine Research and Teaching Department, Great Ormond Street Institute of Child Health,University College London
Summary
هنا نوضح بالتفصيل بروتوكولا محسنا لحقن الوريد الجانبي للفأر لإدارة الفيروس المرتبط بالغدي (AAV) بشكل منهجي في الفئران البالغة. بالإضافة إلى ذلك ، نصف بروتوكولات المقايسات شائعة الاستخدام لتقييم نقل AAV.
Abstract
تؤثر العديد من الاضطرابات على أعضاء متعددة أو تشمل مناطق مختلفة من الجسم ، لذلك من الأهمية بمكان تقديم العلاجات بشكل منهجي لاستهداف الخلايا المصابة الموجودة في مواقع مختلفة. الحقن في الوريد هو طريق توصيل جهازي يستخدم على نطاق واسع في الدراسات قبل السريرية التي تقيم العلاجات المخصصة للإعطاء على مستوى الجسم. في الفئران البالغة ، فإنه ينطوي على إعطاء عن طريق الوريد للعامل العلاجي في عروق الذيل الجانبية للفأر. عند إتقانها ، تكون حقن الوريد الخلفي آمنة وسريعة ، ولا تتطلب سوى أدوات بسيطة ومتاحة بشكل شائع. ومع ذلك ، فإن حقن الوريد الذيل يمثل تحديا تقنيا ويتطلب تدريبا مكثفا وممارسة مستمرة لضمان التسليم الدقيق للجرعة المقصودة.
نصف هنا بروتوكولا مفصلا ومحسنا ومحكما لحقن الوريد الجانبي الذي طورناه بناء على تجربتنا والتوصيات التي سبق أن أبلغت عنها مجموعات أخرى. بخلاف قيود الفئران ومحاقن الأنسولين ، يتطلب هذا البروتوكول فقط الكواشف والمعدات المتوفرة بسهولة في معظم المختبرات. وجدنا أن اتباع هذا البروتوكول يؤدي إلى توصيل ناجح باستمرار عن طريق الوريد للفيروس المرتبط بالغدي (AAV) في أوردة الذيل للفئران غير المخدرة التي تبلغ من العمر 7-9 أسابيع. بالإضافة إلى ذلك ، نصف البروتوكولات المثلى للكشف النسيجي عن بروتينات المراسل الفلوري وجينوم الناقل لكل جينوم ثنائي الصبغيات (vg / dg) يستخدم لتقييم نقل AAV والتوزيع الحيوي. الهدف من هذا البروتوكول هو مساعدة المجربين في إجراء حقن الوريد الذيل بسهولة بنجاح وثبات ، مما قد يقلل من وقت الممارسة اللازم لإتقان هذه التقنية.
Introduction
تشكل الاضطرابات أحادية الجين 80٪ من الأمراض النادرة ، والتي تؤثر مجتمعة على 300 مليون فرد في جميع أنحاء العالم 1,2. لا توجد حاليا علاجات علاجية معتمدة لغالبية هذه الاضطرابات النادرة المنهكة إلى حد كبير1،2،3. ومع ذلك ، فإن الاضطرابات أحادية المنشأ هي المرشحين المثاليين للعلاجات الجينية التي يمكن أن تحل محل الجينات المختلة وظيفيا أو تكميلها أو تصحيحها أو إسكاتها 4,5. حاليا ، يتم تطوير ناقلات متعددة واستخدامها لتقديم العلاجات الجينية لأنواع معينة من الخلايا 4,6. أحد هذه النواقل هو الفيروس المرتبط بالغدي (AAV). AAV هو فيروس بارفو غير ممرض يستخدم بشكل متزايد كناقل للعلاج الجيني7. بالمقارنة مع النواقل الفيروسية الأخرى ، تتمتع AAV بمناعة أقل ، وإمكانية أقل للاندماج في جينوم المضيف ، والقدرة على تحويل الخلايا المنقسمة وغير المنقسمة بكفاءة في الأنسجة المختلفة 7,8. بالإضافة إلى ذلك ، تم تطوير مناهج متعددة لهندسة وتحديد AAVs ذات الخصائص المرغوبة مثل انتحاء الأنسجة المحدد أو زيادة انخفاض المناعة ، مما يعزز بشكل كبير تعدد استخدامات AAV كناقل فيروسي لمؤشرات مختلفة9. جعلت هذه العوامل AAV ناقلا للعلاج الجيني تم التحقيق فيه على نطاق واسع وأدت إلى تطوير العديد من العلاجات الجينية القائمة على AAV المعتمدة من إدارة الغذاء والدواءالأمريكية 10.
تستخدم نماذج الفئران بشكل شائع لاختبار العلاجات الجينية المحتملة في الجسم الحي وفهم الآليات المرضية للاضطرابات أحادية المنشأ بشكل أفضل. ويرجع ذلك إلى تلخيص نماذج الفئران لأمراض الحالات المختلفة ، وتشابه جينومها مع الجينوم البشري ، والسهولة النسبية للتعامل مع الفئران وصيانتها وتوليدها11،12،13. يعد الاختبار في الجسم الحي مهما بشكل خاص عند دراسة الاضطرابات التي تؤثر على أنظمة أو مناطق متعددة من الجسم ، مثل ضمور العضلات. بالنسبة لهذه الاضطرابات ، قد لا يكون الاختبار في المختبر كافيا لإجراء تقييم شامل للسلامة والفعالية والحرائك الدوائية والديناميكا الدوائية للعلاجات التي تهدف إلى الوصول إلى مناطق الجسم المختلفة بعد الإدارة الجهازية14.
يمكن استخدام طرق الإدارة الجهازية المختلفة لتوصيل الأدوية. كل طريق له مزاياه وعيوبه ودرجة توافقه مع النموذج الحيواني والدواء الذي يتم التحقيق فيه15. يعد حقن الوريد الجانبي الوريدي (IV) طريقا شائع الاستخدام للتوصيل الجهازي ل AAV في الفئران16. تسمح حقن الوريد الذيل الجانبي بإعطاء سريع ومباشر للحقن في مجرى دم الفأر مما يضمن التوافر البيولوجي العالي للدواء في الدورة الدموية الجهازية17. كما أنها تتطلب أدوات بسيطة نسبيا ومتاحة بشكل شائع ليتم تنفيذها. ومع ذلك ، ويرجع ذلك أساسا إلى قطر الوريد الذيل الصغير وصعوبة تحديد موقع الوريد ، فإن حقن الوريد الجانبي يمثل تحديا تقنيا ويتطلب درجة عالية من المهارة والممارسة المستمرة لتجنب محاولات الحقن الفاشلة أو تسليم الجرعة غير المكتملة16،17،18،19. يمكن أن يؤدي ذلك إلى فقدان الكواشف باهظة الثمن أو نتائج غير دقيقة ، خاصة إذا لم يتم التعرف على الحقن غير المكتمل أثناء إجراء الحقن. تستند تجربتنا الملخصة هنا إلى البروتوكولات الواردة في المقالات الموثقة جيدا والتي قمنا بتكييفها لاستخدامنا ، وتحسين الخطوات المختلفة لإجراء حقن الوريد الجانبي لضمان الحقن الناجح باستمرار 20،21،22،23،24،25،26،27.
هنا ، نصف بروتوكول حقن الوريد الجانبي الجانبي المحسن المفصل هذا لتوصيل AAV إلى الفئران غير المخدرة التي يبلغ عمرها 7-9 أسابيع باستخدام أدوات بسيطة ومتاحة بشكل شائع. بالإضافة إلى ذلك ، نحن نقدم بروتوكولات للطرق المستخدمة لتقييم تسليم AAV والتوزيع الحيوي. تغطي هذه البروتوكولات جمع الأنسجة بعد الحقن ، وتثبيت الأنسجة ، واستخراج الحمض النووي ، وجينوم ناقل تفاعل البلمرة المتسلسل الرقمي (dPCR) لكل جينوم ثنائي الصيغة الصبغية (vg / dg). يهدف بروتوكول الحقن الوريدي والمؤشرات المقدمة هنا إلى تعزيز سهولة إجراء حقن الوريد الجانبي بنجاح. من المحتمل أن يساعد ذلك في تقليل الوقت اللازم لإتقان مهارات الحقن مع تحسين دقة واتساق الحقن في نفس الوقت.
Protocol
تمت الموافقة على جميع إجراءات التعامل مع وحقنها من قبل لجنة رعاية في NINDS. تم إجراء جميع الإجراءات الحيوانية وفقا لإرشادات رعاية واستخدام NINDS. 1. إعداد ما قبل الحقن إعداد جرعة AAVتحديد متوسط وزن الفئران التي سيتم حقنها. حساب الحد الأقصى المسموح به لحجم الحقن وفقا لإرشادات رعاية الخاصة بالمؤسسة كما هو موضح في المعادلة (1). عادة ما يكون الحد الأقصى لحجم الحقن هو قيمة الحجم (μL) / وزن الماوس (g) (على سبيل المثال ، 10 μL / g.).الحد الأقصى لحجم الحقن (ميكرولتر) / الماوس = (الحد الأقصى لحجم الحقن (ميكرولتر / جم)) × (متوسط وزن الماوس (جم)) (1)ملاحظة: حساب العينة: الحد الأقصى لحجم الحقن / الماوس = 10 ميكرولتر / جم × 20 جم / ماوس = 200 ميكرولتر / ماوس اضبط جرعة الجينوم المتجه AAV (vg) ليتم تسليمها لكل ماوس.ملاحظة: قد تكون هذه هي نفس القيمة المطلقة عبر الفئران المختلفة (على سبيل المثال ، تتلقى جميع الفئران 1.5 × 1012 vg بغض النظر عن مقدار وزن كل فأر). أو يمكن أن تكون الجرعة في vg / kg ، لذلك يجب حساب إجمالي vg المراد حقنه لكل فأر وفقا لوزن هذا الفأر في يوم الحقن.إذا كانت الجرعة في vg / kg ، قم بوزن كل فأر في يوم الحقن السابق لإعداد الجرعة. احسب الجينوم المتجه الذي سيتم تسليمه لكل فأر وفقا لوزنه باستخدام المعادلة (2):الجينومات المتجهة التي سيتم تسليمها في فأر معين (vg) = قيمة vg / kg المحددة مسبقا (vg / kg) × (2)ملاحظة: قد يكون استخدام vg / kg كوحدة جرعة بدلا من vg / mouse أكثر ملاءمة في بعض الدراسات قبل السريرية لضمان مقارنات صحيحة بين الجرعات المحقونة. ويرجع ذلك إلى اختلافات الوزن بين الفئران الذكور والإناث من نفس العمر أو ربما بين الفئران من نفس الجنس. استخدم الحد الأقصى لحجم الحقن وجرعة AAV (vg) لحساب أحجام مخزون AAV والمحلول الملحي المعقم المخزن بالفوسفات (PBS) اللازمة لإعداد الجرعة المطلوبة (انظر المعادلات (3-6)). تأكد من أن الحجم المراد حقنه يساوي أو أقل من الحد الأقصى المسموح به لحجم الحقن. قم دائما بإعداد حجم حقن أكبر بمقدار 15 ميكرولتر على الأقل من الحجم الذي سيتم حقنه لحساب أخطاء السحب والمساحة الميتة للحقنة.تركيز الحقن (vg / μL) = (3)إجمالي جينومات ناقلات AAV المراد إضافتها لتحضير الحقن (vg) = تركيز الحقن (vg / μL) × الحجم المراد تحضيره (μL) (4)حجم مخزون AAV المراد إضافته لتحضير الحقن) (ميكرولتر) = (5)حجم PBS المراد إضافته لتحضير الحقن (μL) = الحجم المراد تحضيره (μL) – حجم مخزون AAV المراد إضافته لتحضير الحقن (μL) (6)ملاحظة: حساب العينة:6 × 10سيتم تسليم 13 vg / kg (الجرعة) في 200 ميكرولتر / فأر (الحجم المراد حقنه) في فأر يزن 25 جم. عيار مخزون AAV هو 3.0 × 1013 (vg / mL)الجينومات المتجهة التي سيتم تسليمها في هذا الفأر المحدد (vg) = 6 × 1013 (vg / kg) × = 1.5 × 1012 vg لهذا الماوستركيز الحقن = = 7.5 × 109 (vg / μL)إجمالي جينومات ناقلات AAV المراد إضافتها لتحضير الحقن = 7.5 × 109 (vg / μL) × (200 (μL) + 15 (μL)) = 1.6125 × 1012 (vg)حجم مخزون AAV المراد إضافته لتحضير الحقن = = 53.75 (ميكرولتر)حجم PBS المراد إضافته لتحضير الحقن = 215 (ميكرولتر) – 53.75 (ميكرولتر) = 161.25 (ميكرولتر) إجراء تحضير جرعة AAVملاحظة: باتباع إرشادات السلامة البيولوجية ومعدات الوقاية الشخصية الخاصة بالمؤسسة للتعامل مع AAV ، في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم خال من RNase وخالي من DNase سعة 1.7 مل ، قم بإعداد حقن AAV باستخدام مخزون AAV و PBS المعقم وفقا للحسابات الواردة في الخطوة 1.1.3.3. احتفظ دائما بحقن المخزون AAV و AAV على الجليد. استخدم ماصات دقيقة نظيفة وصناديق أطراف ماصة جديدة لضمان العقم. تخلص من أطراف الماصة الدقيقة الملوثة ب AAV وفقا لإرشادات إدارة النفايات الخاصة بالمؤسسة.ذوبان الجليد الأسهم AAV على الجليد.ملاحظة: تجنب إذابة وإعادة تجميد مخزون AAV. إما أن تطلب أو تحضر مخزون AAV في قسمة من 100-200 ميكرولتر لتجنب وجود AAV زائد بعد تحضير الجرعة التي ستحتاج إلى إعادة تجميدها. إعداد محطة الحقنتنظيفنظف منطقة العمل بنسبة 70٪ إيثانول (EtOH). قم بتطهير منطقة العمل باستخدام كاشف (كواشف) مبيد للجراثيم والفطريات ومبيد للفيروسات. نظف مثبت أنبوب الماوس بالماء والصابون. إعداد أدوات المحطةضع أنبوبا مخروطيا فارغا نظيفا سعة 15 مل في حامل / رف أنبوب. قم بإعداد منصة مرتفعة يتم وضع مثبت أنبوب الماوس عليها (الشكل 1 أ ، ب). ضع مقيد أنبوب الماوس النظيف في منطقة العمل. في حالة حقن الفئران الأصغر بكثير من المقيد المتاح لأنبوب الماوس ، استخدم مخروط تقييد القوارض البلاستيكية لعمل غلاف تقييد. انظر الخطوات 2.1.3-4. ضع المحاقن التي سيتم استخدامها للحقن في منطقة العمل. استخدم محاقن الأنسولين 0.3 مل مع إبر 29 جرام. ضع حاوية النفايات في أقرب مكان ممكن من محطة الحقن للسماح بالتخلص الفوري من الأدوات الملوثة ب AAV. اسحب مكبس كل حقنة وادفعه عدة مرات للتأكد من أن المكبس يتحرك بسلاسة حتى لا تكون هناك مقاومة تسببها المحاقن أثناء الحقن. إذا لم يتحرك المكبس بسلاسة ، فتخلص من هذه المحقنة واستبدلها بأخرى جديدة. احصل على مقياس ماوس وأجهزة طرد مركزي صغيرة متاحة بجوار منطقة الحقن. جهز AAV المحضر على الثلج في منطقة الحقن. تحضير الماء الدافئ (38-40 درجة مئوية). احرص على ألا تتجاوز درجة حرارة الماء 40 درجة مئوية لتجنب التسبب في حروق في ذيل الفأر. 2. إجراء الحقن تقييد الماوسقم بوزن كل فأر لحساب الجرعة في vg / kg إذا لزم الأمر. تأكد من أن الماوس مقيد تماما وغير قادر على الحركة.ملاحظة: إذا لم يتم تقييد الماوس بالكامل ، فقد يتحرك أثناء الإعطاء الوريدي مما يؤدي إلى إزاحة الإبرة. قد يتسبب ذلك في خروج الإبرة من الوريد و / أو إصابة الفأر. لتقييد الأنبوب:اغسل المقيد بالماء الدافئ والصابون بين الفئران لتنظيف وتسخين الحامل. امسك الماوس من ذيله. أدخل ذيل الماوس في الفتحة العلوية للأنبوب ؛ ثم اسحب الماوس ببطء إلى مثبت الأنبوب. إذا كان حجم مقيد الأنبوب مناسبا لحجم الماوس ، فضع القابس أمام الماوس لمنع الماوس من الهروب.ملاحظة: يجب أن يكون القابس قريبا بدرجة كافية من الماوس لمنع الماوس من التحرك أو الدوران داخل الأنبوب ، ولكن يجب ألا يعيق القابس أنف الماوس للسماح للماوس بالتنفس بحرية. إذا كان الماوس أصغر من حجم المقيد الأنبوبي ، فاستخدم مخروط تقييد مرن يمكن التخلص منه بالإضافة إلى مثبت الأنبوب كما هو موضح أدناه في الخطوة 2.1.4. بالنسبة لمخاريط التقييد المرنة التي تستخدم لمرة واحدة إذا لزم الأمر (لعمل غلاف تقييد للفئران الصغيرة):قم بعمل قطع في نهاية أنف المخروط للتأكد من عدم انسداد أنف الفأر وأن الماوس لديه مساحة كافية للتنفس. قم بقص الجزء الخلفي من المخروط بحيث يكون المخروط بنفس طول الماوس تقريبا (بحيث يتناسب المخروط داخل الأنبوب) (الشكل 1 أ ، ب). ضع الماوس في مقيد الأنبوب كما هو موضح أعلاه في الخطوات 2.1.3. أثناء الضغط على ذيل الماوس ، أدخل مخروط التقييد مع جانب الفتح الأوسع أولا في الأنبوب. أثناء الإمساك بذيل الماوس ، دع الماوس يسير في المخروط ؛ ثم حرك بقية المخروط في الأنبوب. تأكد من أن ذيل الماوس على طول الطريق للخروج من الجزء الخلفي من الأنبوب ، وأن الماوس لديه مساحة للتنفس داخل المخروط. قم بتأمين قابس الأنبوب مباشرة أمام فتحة أنف المخروط مع التأكد من أن الماوس مقيد تماما ولديه مساحة كافية للتنفس. حقن الفأراملأ الأنبوب المخروطي سعة 15 مل بالماء الدافئ. ضع المقيد الأنبوبي مع الماوس بداخله على المنصة المرتفعة (الشكل 1 ب). اغمس أكبر قدر ممكن من ذيل الفأر المقيد في الماء الدافئ لمدة دقيقة واحدة على الأقل حتى تتوسع الأوردة الجانبية بوضوح وتكون مرئية (الشكل 1 ب). أثناء خطوة تسخين الذيل ، قم بتحميل جرعة AAV في المحقنة.ضع أنبوب الطرد المركزي الدقيق غير المغطى المحتوي على AAV سعة 1.7 مل في رف أنبوبي. أدخل الإبرة عموديا في الأنبوب باليد المهيمنة. بمجرد أن تكون الإبرة داخل الأنبوب ، أمسك الأنبوب باليد غير المهيمنة.ملاحظة: يمنع الإدخال الرأسي للإبرة تلف الإبرة الذي قد ينتج عن لمس جدار الأنبوب. يمكن استخدام طرق بديلة أخرى لتحميل المحاقن ، ولكن يجب ضمان سلامة المجرب والفأر المحقون. إن إمساك الأنبوب باليد غير المهيمنة يحمي من إصابات ثقب الإبرة العرضية إذا تم إدخال الإبرة أثناء الإمساك بالأنبوب. باستخدام الإبرة داخل الأنبوب ، ارفع الأنبوب والمحقنة في وقت واحد إلى مستوى العين مع التأكد من أن الإبرة لا تلمس جدار الأنبوب. ضع كلا الذراعين على الطاولة لتثبيتهما. اسحب الجرعة ببطء إلى المحقنة.ملاحظة: يمنع الشفط البطيء فقاعات الهواء الدقيقة من الالتصاق بجوانب أسطوانة المحقنة. طرد فقاعات الهواء من المحقنة. في حالة حقن AAV ، تأكد من طرد فقاعات الهواء من المحقنة فوق وسادة ماصة يمكن التخلص منها والتي سيتم التخلص منها في صندوق الخطر البيولوجي. امسك الحقنة لمدة 40 ثانية على الأقل لتسخينها.ملاحظة: تأكد دائما من أن الحقن دافئ قبل الحقن. إذا تم إعطاء الحقن البارد ، فقد لا يتدفق الحقن عبر الوريد باستثناء الميكرولتر القليلة الأولى. تحقق من أوردة الذيل كل دقيقة.ملاحظة: يجب أن تكون الأوردة مرئية جدا على طول الطريق إلى موقع الحقن (أضف وقت تسخين الذيل واستبدله بالماء الدافئ العذب حسب الحاجة حتى يصبح الوريد مرئيا بوضوح ولكن لا يتجاوز وقت تقييد الماوس المسموح به بموجب بروتوكول التعامل مع الخاص بالمؤسسة). بعد التأكد من أن الأوردة مرئية بوضوح ، قم بإزالة مثبت الأنبوب من أعلى المنصة المرتفعة وضع مثبت الأنبوب مباشرة على الطاولة. ضع الماوس في المقيد مع وضع قدميه لأسفل وليس على الجانب لسهولة التعامل مع الذيل.ملاحظة: يجب ألا يكون الماوس على جانبه أو خلفه داخل المقيد. يجب أن يكون الماوس مقيدا تماما وغير قادر على التحرك أو الدوران داخل المقيد أو تحريك / سحب ذيله. امسح الذيل بسرعة بشاش لتجفيف الذيل ؛ امسح الذيل بمسحة كحولية ثم امسحه حتى يجف بشاش جاف.ملاحظة: استخدم شاشا جافا لجعل الذيل جافا بدرجة كافية للسماح بإمساك الذيل بشكل آمن ولكن ليس جافا تماما. قد يكون من الصعب رؤية الوريد عندما يكون الذيل جافا تماما. قم بتدوير الذيل بزاوية 90 درجة تقريبا إلى اليسار أو اليمين بحيث يكون أحد الأوردة الجانبية متجها لأعلى. حدد موقع الحقن المناسب داخل الثلث الأوسط من الذيل. ابدأ الحقن الأولي بعيدا (أقرب إلى طرف الذيل) وتحرك بالقرب إذا كانت هناك حاجة إلى حقن إضافية بسبب محاولات فاشلة أو اقتضاها التصميم التجريبي.ملاحظة: لا تحاول حقن البعيدة إلى موقع الحقن السابق لأن الحقن قد يتسرب من موقع الحقن السابق. اختياري: استخدم إبهام اليد غير المهيمنة والسبابة لتطبيق الضغط القريب (المنبع / أقرب إلى جسم الماوس) إلى موقع الحقن لمدة 10 ثوان. تعمل الأصابع كعاصبات لتوسيع الوريد في موقع الحقن. مباشرة بعد عاصبة 10 ثوان ، حرر أصابع العاصبة وتأكد من أن أحد الأوردة الجانبية متجها لأعلى ومرئيا بوضوح. امسك الذيل باليد غير المهيمنة باستخدام الإبهام والسبابة بعيدا على الفور إلى موقع الحقن. قم بطي الذيل فوق السبابة بحيث يكون موقع الحقن مسطحا على السبابة. اسحب الذيل للخلف بحيث يتمدد الذيل ويكون موقع الحقن أفقيا تماما (عند 0 درجة) (موازيا للطاولة الأفقية) (الشكل 1C). أمسك المحقنة باستخدام السبابة والأصابع الوسطى لليد المهيمنة على جانبي شفة أسطوانة المحقنة مع إبقاء الإبهام جاهزا عند المكبس.ملاحظة: سيسهل ذلك عدم تحريك الإبهام أو الإبرة بمجرد دخول الإبرة داخل الوريد (الشكل 1C). ضع كلتا يديك على الطاولة لتثبيتهما وضع الإبرة مباشرة على الذيل والوريد وموازيين لهما مع توجيه الشطبة لأعلى. حافظ على موقع الحقن بالقرب من السبابة التي تمسك الذيل لتحسين التحكم في موقع الحقن واستقراره.ملاحظة: يجب أن يكون المقيد الأنبوبي عميقا بدرجة كافية في الطاولة بحيث يتم دعم كلتا اليدين على الطاولة. مع الحفاظ على الإبرة موازية لوريد الذيل والضغط لأسفل على الإبرة ، حرك الإبرة للأمام في الوريد.ملاحظة: يجب أن يكون الضغط الهابط كافيا لإدخال الإبرة بالزاوية الصحيحة في الوريد. الوريد ضحل للغاية ، لذلك يجب أن تكون الإبرة مسطحة قدر الإمكان عند محاولة الدخول إلى الوريد. حقن ببطء الحل في الوريد. بعد إعطاء الجرعة ، اسحب الإبرة ببطء واضغط على الفور بشاش في موقع الحقن لمدة 10 ثوان على الأقل لوقف النزيف.ملاحظة: استخدم الضغط طالما دعت الحاجة حتى يتوقف النزيف تماما لتجنب الخسارة المحتملة للكاشف المحقون. تظهر قطرة دم عادة بعد سحب الإبرة مما يشير إلى أن الإبرة قد اخترقت الوريد. في بعض الأحيان ، لا تظهر قطرة الدم حتى مع الحقن الناجح. قطرة الدم لا تشير إلى الحقن الناجح. إنه يشير فقط إلى أن الإبرة اخترقت الوريد. مؤشر الحقن الناجح الموثوق به هو الغياب التام لمقاومة المكبس أثناء الحقن. إذا كانت الإبرة داخل الوريد ، فلا ينبغي أن تكون هناك مقاومة عند مكبس الإبرة أثناء حقن الحقن ، وسيظهر الوريد القريب من موقع الحقن للحظات أفتح قليلا في اللون (بلانش) (قد لا يكون ابيضاض الوريد واضحا جدا في بعض سلالات الفئران). إذا كانت هناك مقاومة و / أو بدأ الانتفاخ في الظهور في موقع الحقن ، فلن يتم وضع الإبرة بشكل صحيح داخل الوريد. في حالة حدوث ذلك ، قم بإزالة الإبرة تماما من الذيل وحاول حقن الوريد في موقع حقن جديد قريب من موقع الحقن الفاشل (أقرب إلى جسم الفأر). تخلص من المحاقن والأنابيب الملوثة ب AAV وفقا لإرشادات إدارة النفايات الخاصة بالمؤسسة. حرر الفأر من القيود وضعه مرة أخرى في قفص جديد منفصل عن الفئران غير المحقونة. راقب الفئران لمدة 10 دقائق لضمان مستويات النشاط الطبيعي بعد الحقن.ملاحظة: هذا يتجنب الانتقال المحتمل للعوامل المحقونة إلى الفئران غير المحقونة إذا تم إعطاء عوامل قابلة للانتقال. تطهير منطقة العمل باستخدام كواشف (كواشف) مبيد للجراثيم والفطريات والفيروسات و 70٪ EtOH. نظف مثبت أنبوب الماوس بالماء والصابون. 3. تشريح وجمع الأنسجة وتثبيتها27 إعداد محطة جمع الأنسجةقم بتنظيف محطة العمل باستخدام كاشف تحلل الحمض النووي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لتحلل الحمض النووي الملوث الذي قد يكون موجودا في منطقة العمل. ضع ميثيل البيوتان في وعاء معدني. ضع حاوية ميثيل البوتان المعدنية داخل صندوق الستايروفوم ؛ بعد ذلك ، قم بإحاطة الحاوية المعدنية بالثلج الجاف بحيث يكون مستوى الثلج الجاف المحيط بالحاوية أعلى من مستوى ميثيل البيوتان داخل الحاوية. قم بتسمية ووضع أنابيب تخزين أنسجة الطرد المركزي الدقيقة سعة 2 مل فارغة على الثلج الجاف. اترك أنابيب ميثيل البيوتان وأنابيب تخزين الأنسجة لتبرد على الثلج الجاف لمدة 20 دقيقة على الأقل قبل البدء في تجميد الأنسجة. ضع ملقط نقل الأنسجة على الثلج الجاف. قم بتسمية وملء مجموعة أخرى من أنابيب تخزين أنسجة الطرد المركزي الدقيقة سعة 2 مل ببارافورمالدهايد جديد بنسبة 4٪ (PFA) واحتفظ بها في درجة حرارة الغرفة. أضف ما يكفي من 4٪ PFA إلى كل أنبوب لغمر الأنسجة التي سيتم وضعها في الأنبوب بالكامل. جمع الأنسجة وتثبيتهاالقتل الرحيم للفأر وفقا لإرشادات رعاية الخاصة بالمؤسسة.ملاحظة: هنا ، تم القتل الرحيم للفئران باستخدام خلع عنق الرحم. رش الماوس بالكامل مع 70 ٪ EtOH. جمع الأنسجة المطلوبة.ملاحظة: تم اختبار بروتوكول الجمع والتثبيت الموصوف هنا على عضلات الهيكل العظمي والكبد. للأنسجة التي سيتم استخدامها لاستخراج الحمض النووي:إسقاط الأنسجة في ميثيل البيوتان المبردة مسبقا على الثلج الجاف وترك الأنسجة في ميثيل البيوتان لمدة 1 دقيقة على الأقل. استخدم ملقط النقل المبرد مسبقا لنقل الأنسجة المجمدة من ميثيل البيوتان إلى أنابيب تخزين أنسجة الطرد المركزي الفارغة سعة 2 مل المبردة. يخزن المنديل في درجة حرارة -80 درجة مئوية.ملاحظة: اختياري: يمكن تقطيع الأنسجة إلى قطع 20 مجم قبل إسقاطها في ميثيل البيوتان لتكون جاهزة للاستخدام في الخطوة 4.1.4. بالنسبة للأنسجة التي سيتم استخدامها للتحليل النسيجي وللحفاظ على مضان البروتينات المراسلة:باستخدام ملقط مخصص من قبل PFA يتم الاحتفاظ به في درجة حرارة الغرفة ، قم بإسقاط الأنسجة في أنبوب الطرد المركزي الدقيق الخاص بها والذي يحتوي على 4٪ PFA (يتم الاحتفاظ به في درجة حرارة الغرفة) مع التأكد من غمر الأنسجة بالكامل في محلول PFA بنسبة 4٪.ملاحظة: يمكن أن يؤثر تلوث PFA سلبا على المقايسات الجزيئية المختلفة في المصب. استخدم فقط الملقط المعين من قبل PFA عند التعامل مع PFA لمنع تلوث PFA للأنسجة أو الأدوات الأخرى. ضع أنابيب الطرد المركزي الدقيقة على رف وقم بتغطية الرف بورق القصدير لإبقاء الأنابيب في الظلام. احتضن الرف المغطى على حرارة 4 درجات مئوية على شاكر مع رج لطيف طوال الليل. بعد الحضانة طوال الليل ، تحضير 5٪ سكروز (٪ وزن / حجم) في 1x PBS عن طريق إذابة 5.0 جم من السكروز في 70 مل من 1x PBS عن طريق الهز القوي. أضف ما يكفي من 1x PBS إلى الحجم الإجمالي النهائي البالغ 100 مل لتحقيق محلول سكروز 5٪ (٪ وزن / حجم). تعقيم محلول السكروز 5 ٪ باستخدام مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر. قم بتسمية وملء أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 2.0 مل بالسكروز الطازج بنسبة 5٪. نقل الأنسجة من 4٪ PFA إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق الخاص بها والذي يحتوي على 5٪ سكروز (محفوظ في درجة حرارة الغرفة) مع التأكد من غمر الأنسجة بالكامل في محلول السكروز 5٪. ضع أنابيب الطرد المركزي الدقيقة على رف وقم بتغطية الرف بورق القصدير لإبقاء الأنابيب في الظلام. احتضن الرف المغطى على حرارة 4 درجات مئوية على شاكر مع رج لطيف طوال الليل. بعد الحضانة طوال الليل ، قم بإعداد 20٪ سكروز (٪ وزن / حجم) في 1x PBS عن طريق إذابة 20.0 جم من السكروز في 70 مل من 1x PBS عن طريق الهز القوي. أضف ما يكفي من 1x PBS إلى الحجم الإجمالي النهائي البالغ 100 مل لتحقيق محلول سكروز بنسبة 20٪ (٪ وزن / حجم). تعقيم محلول السكروز 20 ٪ باستخدام مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر. قم بتسمية وملء أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 2.0 مل بالسكروز الطازج بنسبة 20٪. نقل الأنسجة من 5٪ سكروز إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق الخاص بها والذي يحتوي على 20٪ سكروز (محفوظ في درجة حرارة الغرفة) مع التأكد من غمر الأنسجة بالكامل في محلول السكروز 20٪. ضع أنابيب الطرد المركزي الدقيقة على رف وقم بتغطية الرف بورق القصدير لإبقاء الأنابيب في الظلام. احتضن الرف المغطى على حرارة 4 درجات مئوية على شاكر مع رج لطيف طوال الليل. بعد الحضانة طوال الليل ، ضع ميثيل البيوتان في وعاء معدني وضع حاوية ميثيل البيوتان المعدنية داخل صندوق الستايروفوم. أحط الحاوية المعدنية بالثلج الجاف بحيث يكون مستوى الثلج الجاف المحيط بالحاوية أعلى من مستوى ميثيل البيوتان داخل الحاوية. قم بتسمية ووضع أنابيب تخزين أنسجة الطرد المركزي الدقيقة سعة 2 مل فارغة على الثلج الجاف. اترك أنابيب ميثيل البيوتان وأنابيب تخزين الأنسجة لتبرد على الثلج الجاف لمدة 20 دقيقة على الأقل قبل البدء في تجميد الأنسجة. ضع ملقط النقل على الثلج الجاف. لطخة الأنسجة بسرعة باستخدام مناديل دقيقة لإزالة أي سكروز زائد بنسبة 20٪. إسقاط الأنسجة في ميثيل البوتان المبردة مسبقا على الثلج الجاف. اترك المنديل في ميثيل البوتان لمدة 1 دقيقة على الأقل. استخدم ملقط النقل المبرد مسبقا لنقل الأنسجة المجمدة من ميثيل البيوتان إلى أنابيب تخزين أنسجة الطرد المركزي الفارغة سعة 2 مل المبردة. يخزن المنديل في درجة حرارة -80 درجة مئوية. 4. dPCR للقياس الكمي vg / dg استخراج الحمض النووي من الأنسجة والهضم الأولي للحمض النووي الريبيملاحظة: تم استخدام كتيب مجموعة استخراج الحمض النووي المدرجة في جدول المواد لاشتقاق بروتوكول استخراج الحمض النووي هذا. احتفظ دائما بالأنابيب التي تحتوي على قطع الأنسجة المجمدة على الثلج الجاف.تحضير دلو من الثلج. لكل عينة من الحمض النووي ، قم بتسمية أنبوب حبة تحلل واحد سعة 1.5 مل وأنبوبي طرد مركزي فارغين خاليين من RNase وخالي من DNase سعة 1.7 مل. أضف 180 ميكرولتر من المخزن المؤقت الأول لمجموعة استخراج الحمض النووي إلى كل أنبوب خرزة. الفارغة أول أنبوب حبة تحتوي على عازلة.ملاحظة: إذا لم يتم قطع الأنسجة مسبقا في الخطوة 3.2.4.1 ، فاستخدم شفرة حلاقة مبردة مسبقا على الثلج الجاف لتقطيع الأنسجة إلى قطع 20 ملغ. يجب أن تتم هذه الخطوة داخل جهاز تبريد نظيف يتم الاحتفاظ به عند -20 درجة مئوية أو أكثر برودة. أضف قطعة واحدة من الأنسجة في الأنبوب ؛ وزن وتسجيل وزن الأنسجة (ليكون ~ 20 ملغ). ضع على الفور أنبوب حبة التحلل مع الأنسجة الموجودة فيه على الجليد. قد يتبلور المخزن المؤقت. كرر الخطوات السابقة لكل عينة من الأنسجة. انقل الأنابيب إلى خلاط أنبوب حبة التحلل وقم بتشغيلها لمدة دقيقة واحدة بأقصى سرعة (السرعة 10) عند 4 درجات مئوية. ضع العينات على الثلج لنقلها إلى جهاز الطرد المركزي. أجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة عند 20000 × جم عند 4 درجات مئوية. أثناء خطوة الطرد المركزي ، أضف 20 ميكرولتر من البروتيناز K إلى السلسلة الأولى من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.7 مل. بعد خطوة الطرد المركزي ، انقل طافية التجانس إلى أنابيب 1.7 مل التي تحتوي على البروتيناز K واخلطها جيدا. احتضان في 56 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، مع خلط 500 دورة في الدقيقة. جمع قطرات من الجدران وغطاء الأنبوب عن طريق الطرد المركزي للأنبوب لمدة 1-2 ثانية باستخدام جهاز طرد مركزي صغير. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة. أضف 4 ميكرولتر من RNase A واخلطها عن طريق دوامة نبضية قصيرة. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة. دوامة النبض لمدة 15 ثانية. جمع قطرات من الجدران وغطاء الأنبوب عن طريق الطرد المركزي للأنبوب لمدة 1-2 ثانية باستخدام جهاز طرد مركزي صغير. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت الثاني لمجموعة استخراج الحمض النووي. دوامة النبض لمدة 15 ثانية. جمع قطرات من الجدران وغطاء الأنبوب عن طريق الطرد المركزي للأنبوب لمدة 1-2 ثانية باستخدام جهاز طرد مركزي صغير. أضف 200 ميكرولتر من 100٪ EtOH. دوامة النبض لمدة 15 ثانية. جمع قطرات من الجدران وغطاء الأنبوب عن طريق الطرد المركزي للأنبوب لمدة 1-2 ثانية باستخدام جهاز طرد مركزي صغير. انقل المحللات إلى عمود دوران استخراج الحمض النووي. تدور في 6000 × غرام لمدة 1 دقيقة. ضع عمود الدوران في أنبوب تجميع جديد. أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت الثالث لمجموعة استخراج الحمض النووي إلى عمود الدوران. تدور في 6000 × غرام لمدة 1 دقيقة. ضع عمود الدوران في أنبوب تجميع جديد. أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لمجموعة استخراج الحمض النووي الرابع إلى عمود الدوران. تدور على حرارة 20000 × جم لمدة 3 دقائق. ضع عمود الدوران في أنبوب طرد مركزي جديد سعة 1.7 مل. أضف 100 ميكرولتر من الماء الجزيئي إلى عمود الدوران. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة. تدور في 6000 × غرام لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بقياس تركيز الحمض النووي إذا لزم الأمر. يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية للتخزين قصير الأجل أو -20 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل. استخراج الحمض النووي من الخلايا المصنفة بواسطة FACSملاحظة: تم استخدام كتيب مجموعة استخراج الحمض النووي المدرجة في جدول المواد لاشتقاق بروتوكول استخراج الحمض النووي هذا.بعد فرز الخلايا ، قم بطرد العينات عند 300 × جم لمدة 5 ثوان لجمع كل القطرات على الجانبين والغطاء. تأكد من جمع كل القطرات.ملاحظة: إذا كان حجم العينة أقل من 1.5 مل ، فانتقل مباشرة إلى الخطوة التالية. إذا كان حجم العينة أكبر من 1.5 مل ، فقم بإزالة الجزء العلوي من المادة الطافية وتجاهله بعناية باستخدام ماصة صغيرة تاركا 1-1.5 مل من العينة. امزج العينة عن طريق السحب لأعلى ولأسفل عدة مرات وانقل العينة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.7 مل. أجهزة الطرد المركزي في 515 × غرام لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية باستثناء آخر 50 ميكرولتر. أعد تعليق الحبيبات في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت الأول لمجموعة استخراج الحمض النووي لحجم نهائي يبلغ 100 ميكرولتر. اتبع بروتوكول الشركة المصنعة لعزل الحمض النووي الجينومي من كميات صغيرة من الدم (انظر جدول المواد).إضافة 10 ميكرولتر من البروتيناز K و 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت الثاني لمجموعة استخراج الحمض النووي ؛ تخلط عن طريق دوامة النبض لمدة 15 ثانية. احتضان العينات عند 56 درجة مئوية لمدة 10 دقائق مع خلط 300 دورة في الدقيقة. امزج العينات مرتين عن طريق الانعكاس اللطيف خلال فترة الحضانة هذه. جمع قطرات من الجدران وغطاء الأنبوب عن طريق الطرد المركزي للأنبوب لمدة 1-2 ثانية باستخدام جهاز طرد مركزي صغير. أضف 50 ميكرولتر من 100٪ EtOH واخلطها عن طريق دوامة النبض لمدة 15 ثانية. احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. جمع قطرات من الجدران وغطاء الأنبوب عن طريق الطرد المركزي للأنبوب لمدة 1-2 ثانية باستخدام جهاز طرد مركزي صغير. انقل العينات إلى عمود استخراج الحمض النووي (العمود في أنبوب تجميع سعة 2 مل) دون ترطيب الحافة. أجهزة الطرد المركزي في 6000 × غرام لمدة 1 دقيقة. بعد وضع العمود في أنبوب تجميع نظيف سعة 2 مل ، تخلص من أنبوب التجميع الذي يحتوي على التدفق. أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت الثالث لمجموعة استخراج الحمض النووي إلى العمود دون ترطيب الحافة وأجهزة الطرد المركزي عند 6000 × جم لمدة 1 دقيقة. مرة أخرى ، بعد وضع العمود في أنبوب تجميع نظيف سعة 2 مل ، تخلص من أنبوب التجميع الذي يحتوي على التدفق. أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لمجموعة استخراج الحمض النووي الرابع إلى العمود دون ترطيب الحافة وأجهزة الطرد المركزي عند 6000 × جم لمدة 1 دقيقة. ضع العمود في أنبوب تجميع نظيف سعة 2 مل وتخلص من أنبوب التجميع المحتوي على التدفق. جهاز طرد مركزي عند 20000 × غرام لمدة 3 دقائق. ضع العمود في أنبوب طرد مركزي نظيف سعة 1.7 مل وتخلص من أنبوب التجميع المحتوي على التدفق. أضف 20 ميكرولتر من الماء الجزيئي إلى مركز غشاء العمود للشطف ؛ أغلق الغطاء واحتضان العينات بالماء الجزيئي في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. أجهزة الطرد المركزي في 20000 × غرام لمدة 1 دقيقة. قم بتخزين الحمض النووي المستخلص عند 4 درجات مئوية للتخزين قصير الأجل أو -20 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل. هضم الحمض النووي الريبي وتنظيفهملاحظة: تم استخدام كتيب مجموعة استخراج الحمض النووي المدرجة في جدول المواد لاشتقاق بروتوكول تنظيف الحمض النووي هذا. اعتمادا على ظروف dPCR والكواشف وتصميمات التمهيدي والمسبار ، قد يكون من الضروري ضمان الغياب التام للحمض النووي الريبي في عينة الحمض النووي قبل الانتقال إلى القياس الكمي dPCR vg / dg. قد يؤدي تلوث الحمض النووي الريبي إلى درجات مختلفة من قيم vg / dg غير الدقيقة في ظل ظروف dPCR معينة.في أنبوب PCR سعة 0.2 مل أو أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.7 مل ، أضف 20 ميكرولتر على الأكثر من عينة الحمض النووي المستخرجة و 1.5 ميكرولتر من RNase الخالي من DNase إلى كل عينة من الحمض النووي. إذا كان حجم مزيج DNA / RNase أقل من 21.5 ميكرولتر ، أضف ما يكفي من الماء الجزيئي إلى الحجم النهائي البالغ 21.5 ميكرولتر واخلط 25x عن طريق قلب الأنابيب. احتضان على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع الخلط الدوري كل 10 دقائق عن طريق قلب الأنابيب.ملاحظة: يجب أن تكون الكمية الإجمالية للأحماض النووية المضافة إلى الأنبوب بين 175 نانوغرام و 700 نانوغرام. قد تكون هناك حاجة إلى تعديلات إذا كانت عينات الحمض النووي تحتوي على أحجام أو كميات من الحمض النووي خارج هذا النطاق أو إذا تم عزل عينات الحمض النووي بشكل مختلف. ضعه على الثلج لمدة 2 دقيقة. أضف كمية كافية من الماء الجزيئي إلى كل مزيج DNA / RNase إلى حجم نهائي يبلغ 100 ميكرولتر.ملاحظة: يوصى باستخدام RNase المدرج هنا لأنه يهضم الحمض النووي الريبي الملوث دون التأثير سلبا على الحمض النووي المستهدف أو فحوصات تفاعل البوليميراز المتسلسل النهائية. اتبع بروتوكول الشركة المصنعة لتنظيف الحمض النووي الجينومي (انظر جدول المواد).أضف 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت لمجموعة استخراج الحمض النووي الأولى و 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت لمجموعة استخراج الحمض النووي الثاني. تخلط بواسطة دوامة النبض لمدة 10 ثوان. انقل العينات إلى عمود استخراج الحمض النووي في أنبوب تجميع سعة 2 مل دون ترطيب الحافة. أجهزة الطرد المركزي في 6000 × غرام لمدة 1 دقيقة. بعد وضع العمود في أنبوب تجميع نظيف سعة 2 مل ، تخلص من أنبوب التجميع الذي يحتوي على التدفق. أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت الثاني لمجموعة استخراج الحمض النووي إلى العمود دون ترطيب الحافة. أجهزة الطرد المركزي في 6000 × غرام لمدة 1 دقيقة. ضع العمود في أنبوب تجميع نظيف سعة 2 مل وتخلص من أنبوب التجميع المحتوي على التدفق. جهاز طرد مركزي عند 20000 × جم لمدة 6 دقائق. ضع العمود في أنبوب طرد مركزي نظيف سعة 1.7 مل وتخلص من أنبوب التجميع الذي يحتوي على التدفق. أضف 20 ميكرولتر من الماء الجزيئي إلى مركز غشاء العمود للشطف ، وأغلق الغطاء ، واحتضان العينات بماء الصف الجزيئي في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. أجهزة الطرد المركزي في 20000 × غرام لمدة 1 دقيقة. يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية للتخزين قصير الأجل أو -20 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل. تأكد من عدم وجود تلوث بالحمض النووي الريبي في العينة المهضومة ب RNase باستخدام نقطة النهاية PCR أو dPCR أو PCR الكمي (qPCR) باستخدام زوج التمهيدي PCR الذي من شأنه تضخيم منطقة mRNA التي تمتد عبر إكسونات متعددة وليس فقط إكسون واحد.ملاحظة: يجب أن يكون هدف mRNA من جين يتم التعبير عنه بشكل كبير في نوع الأنسجة / الخلايا المستهدفة لضمان تحديد تلوث mRNA بشكل صحيح إذا كان موجودا. تفرق الأمبليكونات التي تمتد عبر إكسونات متعددة بين النطاقات الناتجة عن تلويث mRNA مقابل الحمض النووي الجينومي. احتفظ دائما بعينة من الحمض النووي المهضوم غير RNase كعنصر تحكم إيجابي في تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل لضمان اكتشاف تلوث mRNA إن وجد. تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي (dPCR)PCR نقطة النهاية للتحقق من خصوصية البادئات وظروف PCR المثلى (اختياري)تصميم أزواج ومجسات أولية dPCR لأزواج الجينوم المتجه وأزواج التمهيدي dPCR ومجسات للجين المرجعي للفأر الذي سيتم استخدامه لتحديد كمية الجينومات ثنائية الصيغة الصبغية في العينة.ملاحظة: استهدف حجم amplicon بين 60 نقطة أساس و 150 نقطة أساس. يجب أن يكون الجين المرجعي للفأر جينا له رقم نسخ جيني ثابت لكل جينوم ثنائي الصيغة الصبغية. بالنسبة للحسابات المذكورة هنا، يحتوي الجين المرجعي (Polr2a) على نسختين لكل جينوم ثنائي الصيغة الصبغية. بالنسبة لتفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل لنقطة النهاية 10 ميكرولتر ، قم بإعداد مزيج تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام الكواشف والتركيزات النهائية لاستخدامها لاحقا في تفاعل dPCR. أضف عينة الحمض النووي لقالب RNase المهضوم (تتراوح كمية الأحماض النووية 56-223 نانوغرام) إلى تركيز نهائي من 1x dPCR المزيج الرئيسي الذي يحتوي على بوليميراز الحمض النووي و dNTPs ، 0.8 ميكرومتر لكل برايمر أمامي ، 0.8 ميكرومتر من كل برايمر عكسي ، 0.4 ميكرومتر لكل مسبار ، و 0.025 وحدة / ميكرولتر من إنزيم التقييد (يعتمد التركيز النهائي لإنزيم التقييد على إنزيم التقييد والعلامة التجارية المستخدمة). أضف ماء من الدرجة الجزيئية للوصول إلى حجم نهائي يبلغ 10 ميكرولتر.ملاحظة: يجب أن يكون هناك على الأقل زوجان من التمهيدي ومجسان في مزيج تفاعل البوليميراز المتسلسل: زوج تمهيدي واحد ومسبار واحد للكشف عن جينوم المتجه وزوج تمهيدي واحد ومسبار واحد للكشف عن جينوم الفأر. ظروف الدورة الحرارية PCR: خطوة تنشيط الحرارة الأولية عند 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ، تليها 35-45 دورة من خطوة تمسخ عند 95 درجة مئوية لمدة 25 ثانية وخطوة التلدين / التمديد المجمعة عند 58-62 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.ملاحظة: يجب تحديد درجة حرارة التلدين المثلى لكل زوج amplicon و primer. يمكن تعديل عدد الدورات وفقا لكمية قالب الحمض النووي في العينة. تصور منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل على هلام الأغاروز باستخدام الرحلان الكهربائي الهلامي لتحديد وجود نطاقات amplicon المستهدفة وأي نطاقات تضخيم غير محددة محتملة. انتقل إلى خطوة dPCR التالية بعد التأكد من أن أزواج التمهيدي وظروف ركوب الدراجات تؤدي إلى تضخيم محدد للتسلسلات المستهدفة. تفاعل dPCRللحصول على تفاعل dPCR 40 ميكرولتر ، أضف ما يصل إلى 4 ميكرولتر من عينة الحمض النووي للقالب المهضوم ب RNase (تتراوح كمية الأحماض النووية 50-330 نانوغرام) إلى تركيز نهائي من 1x dPCR المزيج الرئيسي الذي يحتوي على بوليميراز الحمض النووي و dNTPs ، 0.8 ميكرومتر من كل التمهيدي الأمامي ، 0.8 ميكرومتر من كل التمهيدي العكسي ، 0.4 ميكرومتر من كل مسبار ، و 0.025 وحدة / ميكرولتر من إنزيم التقييد (يعتمد التركيز النهائي لإنزيم التقييد على إنزيم التقييد والعلامة التجارية المستخدمة). أضف الماء الجزيئي للوصول إلى الحجم النهائي البالغ 40 ميكرولتر. ظروف الدورة الحرارية dPCR: خطوة تنشيط الحرارة الأولية عند 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ، تليها 40-50 دورة من خطوة تمسخ عند 95 درجة مئوية لمدة 25 ثانية ، وخطوة التلدين / التمديد مجتمعة عند 58-62 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.ملاحظة: يجب تحديد درجة حرارة التلدين المثلى لكل زوج amplicon و primer. يمكن تعديل عدد الدورات وفقا لكمية قالب الحمض النووي في العينة. تم تحسين الأحجام والتركيزات والظروف المدرجة هنا لألواح dPCR والكواشف والأجهزة المدرجة في جدول المواد. تقلل هذه الظروف من تأثير أي مثبطات dPCR محتملة قد تقلل من دقة التفاعل. بعد تشغيل تفاعل dPCR والحصول على القيم المطلقة لجينومات المتجه والجين المرجعي للفأر ، احسب vg / dg في العينة باستخدام المعادلات (7-8).بالنسبة للجينات المرجعية التي تحتوي على نسختين جينيتين / جينوم ثنائي الصيغة الصبغية:القيمة المطلقة للجينومات ثنائية الصيغة الصبغية (dg) = (7)vg/dg = (8) تحقق من مخطط التشتت 1D لتفاعل dPCR للتأكد من صحة الفحص والقياس الكمي (الشكل 3A ، C). لكي يكون الفحص صالحا ، تأكد من أن مخطط التشتت 1D يفي بجميع المعايير التالية: وجود أقسام موجبة وسالبة ؛ فصل واضح بين الأقسام الموجبة والسالبة للسماح بتحديد العتبة بدقة ؛ ووجود قطرات لا تقل بين الأقسام الموجبة والسالبة (المعروفة أيضا باسم المطر) ، والتي يمكن أن تقلل من دقة القياس الكمي dPCR.
Representative Results
تم حقن الفئران الذكور البالغة من العمر سبعة إلى تسعة أسابيع ب AAV عن طريق حقن الوريد الجانبي عند 1.5 × 1012 vg / mouse تم تسليمها في 150-200 ميكرولتر من حجم الحقن. قام ssDNA AAV المستخدم هنا بتسليم جين التحوير Cre recombinase مدفوعا بمروج CMV. كانت الفئران المحقونة متماثلة الزيجوت لأليل Cre reporter Ai14. عند تعرضها ل Cre recombinase ، تعبر الخلايا المحتوية على أليل Ai14 عن بروتين tdTomato الفلوري. نظرا لأن تعبير tdTomato ناتج عن إعادة التركيب الجيني الناجم عن Cre ، فإن الخلايا المعبرة عن tdTomato تشير إلى الخلايا التي تم تحويلها مباشرة بواسطة AAV أو كانت خلايا ذرية للخلايا المحولة. البيانات المعروضة هنا هي للفئران المحقونة ب AAV9-CMV-Cre عند 1.5 × 1012 vg / mouse يتم تسليمها في 160 ميكرولتر (5.8-5.9 × 1013 vg / kg). تم التضحية بالفئران بعد 28 يوما من الحقن ، وتم جمع الأنسجة كما هو موضح أعلاه. تم هضم عدد قليل من عضلات الهيكل العظمي وفصوص الكبد ، وتم جمع خلاياها باستخدام FACS. تم تجميد عدد قليل من فصوص الكبد على الفور باستخدام ميثيل البيوتان المبرد مسبقا لاستخراج الحمض النووي. تم تجميد عدد قليل من عضلات الهيكل العظمي وفصوص الكبد للتصوير النسيجي للطماطم الفلورية tdMeatato. تم التعبير عن tdTomato بشكل منتشر في جميع أنحاء الكبد (الشكل 2 أ) وعضلات الفخذ (الشكل 2 ج) مما يشير إلى أن AAV9 وصل على نطاق واسع وحول مناطق مختلفة من كلا النسجين. تم استخدام الحمض النووي المستخرج من الكبد الطازج المجمد والخلايا المصنفة بواسطة FACS لتحديد كمية vg / dg باستخدام dPCR. يمكن استخدام القياس الكمي Vg / dg لتقييم اتساق الحقن وكفاءة نقل AAV في العينة التي تم تحليلها. تم استخدام مخططات تشتت القطيرات 1D من عينة أنسجة الكبد الطازجة المجمدة والخلايا المصنفة بواسطة FACS لضمان صحة الفحص (الشكل 3A ، C). أظهر مخطط التشتت وجود أقسام موجبة وسالبة ، وفصل واضح بين الأقسام الموجبة والسالبة التي تسمح بتحديد دقيق لعتبة الكشف ، ووجود قطرات لا إلى قليلة بين الأقسام الموجبة والسالبة ، والتي يمكن أن تقلل من دقة مقايسة dPCR. يشير استيفاء جميع هذه المعايير إلى أن نتائج فحص dPCR كانت صالحة. تم تحديد عدد نسخ جين Polr2a في كل عينة لتحديد عدد جينومات الفأر ثنائية الصيغة الصبغية (نسختان جينيتان Polr2a / جينوم ثنائي الصبغيات للفأر) ، وتم استخدام البرايمرات / المسبار مقابل تسلسل جين التحوير Cre recombinase لتحديد الجينوم الفيروسي (نسخة واحدة من الجينات المحورة / الجينوم الفيروسي ، الجدول 1). تم تحديد قيمة vg / dg لعينة أنسجة الكبد الطازجة المجمدة والخلايا المصنفة بواسطة FACS وأظهرت وجود 187.7 vg / dg و 4.7 vg / dg في كل عينة ، على التوالي (الشكل 3B ، D). تم استخدام عينات من الفئران المحقونة ب PBS والضوابط غير النموذجية التي لا تحتوي على أحماض نووية كضوابط سلبية. الشكل 1: نظرة عامة على محطة الحقن الوريدي. أ: الأدوات اللازمة لإجراء الحقن الوريدي. يظهر هنا (1) المؤقت ، (2) مقيد أنبوب الماوس ، (3) مخاريط تقييد بلاستيكية غير مقطوعة و (4) مقطوعة ، (5) مسحة كحول ، (6) صندوق أطراف ماصة فارغ يستخدم كمنصة لرفع مقيد أنبوب الماوس ، (7) وسادات ماصة يمكن التخلص منها ، (8) أنبوب مخروطي سعة 15 مل بالماء الدافئ ، (9) حامل أنبوب سعة 15 مل ، (10) شاش ، و (11) حقنة أنسولين. (ب) يوضع الفأر أولا داخل المقيد الأنبوبي. بعد ذلك ، يتم إدخال مخروط تقييد القطع لإنشاء غلاف تقييد حول الماوس ، إذا كان الماوس صغيرا جدا بحيث لا يمكن تقييده بواسطة مقيد الأنبوب فقط. تأكد من عدم إعاقة تنفس الماوس بواسطة القيود. يتم وضع المقيد الأنبوبي أعلى المنصة المرتفعة للسماح بوضع ذيل الفأر في ماء دافئ. (ج) وضع ذيل الفأر وزاوية الإمساك بالإبرة مباشرة قبل إجراء الحقن. اسحب الذيل للخلف حتى يمتد الذيل ، ويكون موقع الحقن أفقيا تماما. الإبرة موازية للذيل والوريد ، والشطبة متجهة لأعلى. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2: الكشف عن بروتين مراسل الفلورسنت بعد الحقن الوريدي. تم حقن الفئران الذكور البالغة من العمر سبعة إلى تسعة أسابيع والتي تؤوي أليل Cre reporter Ai14 عن طريق الحقن الوريدي إما ب AAV9-CMV-Cre عند 1.5 × 1012 vg / mouse تم تسليمها في 160 ميكرولتر (5.8-5.9 × 1013 vg / kg) أو PBS. صور مضان تمثيلية لأقسام كبد الفأر (A) أو (C) رباعية الرؤوس بعد AAV9 لتوصيل حقن Cre IV. (ب) تم تصوير الكبد أو (د) أقسام الفخذ من الفئران المحقونة ب PBS لتكون بمثابة عناصر تحكم سلبية. تم جمع الأنسجة وتجميدها بعد 28 يوما من الحقن الوريدي. التعرض بعد Cre ، يتم التعبير عن بروتين tdTomato الفلوري في الخلايا المحولة وخلايا ذرية الخلايا المحولة. تم تصوير مقاطع بسمك 10 ميكرومتر بتكبير 10x. قضبان المقياس = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 3: الجينوم المتجه لكل جينوم ثنائي الصيغة الصبغية (vg / dg). مخطط تشتت 1D لتقدير كمية جينومات ناقل dPCR في (A) أنسجة الكبد أو (C) الخلايا المصنفة FACS التي تم جمعها من الفئران المحقونة إما ب AAV9-CMV-Cre أو PBS. تظهر مخططات التشتت أقسام dPCR الموجبة والسالبة ، بالإضافة إلى عتبة الكشف المشار إليها بالخط الأفقي عبر العينات. (ب ، د) vg / dg القياس الكمي بعد تحديد كمية جينومات الفأر ثنائية الصيغة الصبغية وجينومات المتجهات في (B) أنسجة الكبد أو (D) عينات الخلايا المصنفة بواسطة FACS. النتائج المعروضة هنا مأخوذة من ماوس واحد محقون ب AAV9 وماوس واحد محقون ب PBS مع تكرار dPCR تقني لكل ماوس. تشير أشرطة الخطأ إلى فاصل الثقة 95٪ لكل عينة. الاختصارات: NTC = عنصر تحكم غير قالب ؛ dPCR = PCR الرقمي ؛ FACS = فرز الخلايا المنشط بالفلورة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. التمهيدي تسلسل كري التمهيدي إلى الأمام CTGACGGTGGGAGAATGTTAAT كري عكس التمهيدي CATCGCTCGACCAGTTTAGTT مسبار كري /56-فام/CGCAGGTGT/زين/AGAGAAGGCACTTAGC/3IABkFQ/ Polr2a التمهيدي الأمامي GACTCCTTCACTCACTGTCTTC Polr2a التمهيدي العكسي TCTTGCTAGGCAGTCCATTATC مسبار Polr2a /5HEX/ACGAGATGC/ZEN/TGAAAGAGCCAAGGT/3IABkFQ/ الجدول 1: تسلسل البادئات والمجسات المستخدمة في القياس الكمي vg / dg. تم استخدام الاشعال Cre والمسبار لتحديد كمية الجينوم المتجه. تم استخدام الاشعال والمسبار Polr2a لتحديد جينوم الفأر ثنائي الصيغة الصبغية.
Discussion
تحمل العلاجات القائمة على AAV إمكانات كبيرة للاضطرابات أحادية المنشأ بسبب تنوع AAV كناقل للعلاج الجيني ، مما يجعل من الممكن تخصيص AAVs لتلبية احتياجات التسليم المختلفة للاضطرابات المختلفة4،5،7،9. عادة ما يتم إعطاء AAVs عن طريق الحقن الوريدي في نماذج الفئران قبل السريرية لاختبار سلامة وفعالية العلاجات المحتملة16. نظرا لأن جرعات AAV المحقونة المختلفة يمكن أن تؤدي إلى اختلافات ملحوظة في النتائج التجريبية ، فمن الأهمية بمكان أن يكون المجربون قادرين على حقن جرعة AAV المقصودة باستمرار لضمان صحة ومتانة البيانات المتولدة في الجسم الحي 28. تستخدم الحقن الوريدية على نطاق واسع ، ولكنها تمثل تحديا تقنيا تتطلب تدريبا مكثفا وممارسة مستمرة لتطوير والحفاظ على مستوى مهارة يضمن الحقن الناجحة باستمرار16،17،18،19. بالإضافة إلى حقن AAV بشكل صحيح ، من المستحسن عادة استخدام المقايسات لتقييم التوزيع الحيوي المحقون ل AAV وكفاءة التوصيل إلى الأنسجة أو الخلايا المستهدفة29,30.
يهدف هذا البروتوكول إلى مساعدة المجربين على إجراء الحقن الوريدي بسهولة بنجاح وثبات من خلال وصف شامل لتفاصيل بروتوكول الحقن الوريدي الأمثل لإدارة AAV في الفئران غير المخدرة البالغة من العمر 7-9 أسابيع. من المهم ملاحظة أن الفئران الأصغر أو الأكبر بشكل ملحوظ من الفئران البرية في الفئة العمرية المستخدمة هنا قد تشكل تحديا أكبر بسبب انخفاض رؤية الأوردة أو عدم التوافق مع القيود المستخدمة في هذه الطريقة. تم الإبلاغ سابقا عن أن حقن الذيل الوريدي ليست مناسبة لإدارة الكواشف عن طريق الوريد في الفئران التي يقل عمرها عن 6 أسابيع بسبب حجم الوعاء الصغير31. على الرغم من أنه ممكن ، فقد يكون من الصعب حقن الفئران التي يقل وزنها عن 22.0 جم بنجاح. قد يحتاج الباحثون الذين يستخدمون الفئران ذات الحجم غير النمطي إلى إجراء تعديلات على الإجراء. يحدد هذا البروتوكول أيضا العديد من المقايسات التي يمكن استخدامها لتقييم التوزيع الحيوي AAV وكفاءة النقل.
يجب مراعاة بعض النقاط الحرجة أثناء اتباع هذا البروتوكول. أثناء الحقن ، توفر إبر 29 جم مقاومة أكبر إذا لم تكن الإبرة داخل الوريد. هذا يقلل من الحجم المفقود من الحقن العرضي حول الأوعية الدموية للمحلول أثناء محاولات الحقن الفاشلة. تحتوي محاقن الأنسولين على أحجام ميتة أصغر من المحاقن العادية. في حالة استخدام حقنة و / أو إبرة مختلفة عن تلك المذكورة هنا ، قد يلزم تحضير حجم حقن إضافي في خطوات البروتوكول 1.1.3.3 لحساب حجم الفضاء الميت الأكبر (على سبيل المثال ، إضافة 30 ميكرولتر إلى الجرعة المقصودة بدلا من 15 ميكرولتر).
إذا تشكلت فقاعات هواء دقيقة ناتجة عن الشفط على جوانب المحقنة أثناء شفط جرعة AAV في المحقنة ، اسحب الحقنة ببطء إلى أعلى المحقنة. سيؤدي ذلك إلى إزالة معظم فقاعات الهواء الصغيرة. قم بتحميل ما لا يقل عن 10-15 ميكرولتر إضافي من AAV إلى الحجم المقصود المراد حقنه. هذا الحجم الإضافي هو حساب أي حجم قد يتم فقده أثناء طرد فقاعات الهواء أو محاولات الحقن الفاشلة المحتملة. (على سبيل المثال ، إذا كان الحجم المستهدف المراد حقنه هو 150 ميكرولتر ، فقم بتحميل 165 ميكرولتر في المحقنة (في منتصف المسافة بين علامتي 160 ميكرولتر و 170 ميكرولتر على مقياس المحقنة). إذا تم وضع الإبرة بشكل صحيح داخل الوريد ، وكان الحجم في المحقنة عند 165 ميكرولتر مباشرة قبل محاولة الحقن الناجحة ، فقم بتوصيل الكاشف حتى يتم ترك 15 ميكرولتر في المحقنة (في منتصف المسافة بين علامات 10 ميكرولتر و 20 ميكرولتر) ، وبالتالي توصيل 150 ميكرولتر (165 ميكرولتر – 150 ميكرولتر = 15 ميكرولتر)). تسمح محاذاة التجويف المائل (مائل متجها لأعلى) مع مقياس المحقنة بتتبع الحجم الذي تم تسليمه أثناء الحقن.
قد يفضل بعض المجربين وضع الفأر على جانبه بحيث يكون أحد عروقه مستقيما ويمكن الوصول إليه بسهولة مقارنة بالفأر على قدميه. ومع ذلك ، فإن ذيل الفأر على جانبه سوف يميل بزوايا مختلفة اعتمادا على حجم الماوس الذي يتطلب تعديل زاوية الحقن عند حقن الفئران ذات الأحجام المختلفة. قد يؤثر هذا سلبا على اتساق نجاح الإجراء. أثناء محاولات الممارسة الأولية ، يمكن للمجربين تجربة كل من اتجاهات تقييد الماوس لتحديد نهجهم المفضل. وجود الماوس على قدميه يسمح بالوصول السريع والسهل إلى كل من عروق الذيل الجانبية. هذا يقلل من وقت التقييد عند الحاجة إلى الوصول إلى كلا الأوردة في حالة محاولات الحقن الفاشلة المتعددة.
في حالة حقن الوريد الجانبي بالقرب من قاعدة الذيل (أقرب إلى جسم الفأر) (خاصة بالنسبة للفئران التي تزن >30 جم) ، اضبط زاوية الحقن من موازية للوريد إلى 5 درجات -10 درجات إلى الوريد لأن الوريد في قاعدة الذيل أعمق قليلا مما هو بعيد.
تم التحقق من بروتوكولات فحص هضم RNase وتلوث الحمض النووي الريبي المدرجة هنا على عينات الحمض النووي المعزولة من أنسجة الكبد الطازجة المجمدة التي تحتوي على ما مجموعه 175-700 نانوغرام من الأحماض النووية في 20 ميكرولتر. كما تم اختبار بروتوكول هضم RNase على عينات الحمض النووي المعزولة من أنسجة الكبد الطازجة المجمدة والخلايا المصنفة بواسطة FACS لتأكيد وجود جينوم الناقل وجينوم الفأر بعد هضم RNase. تم تصور النتائج باستخدام الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز لتضخيم PCR لنقطة النهاية للمضخمات المستهدفة.
يمكن أن يؤدي اتباع المنهجية الموصوفة إلى تقليل وقت التدريب والممارسة اللازمين لإتقان الحقن الوريدي ويؤدي إلى ارتفاع معدل الحقن الناجح ، مما يوفر الكواشف. يستخدم هذا البروتوكول أدوات بسيطة وشائعة الاستخدام دون الحاجة إلى معدات أو إعدادات متقدمة قد لا تكون متاحة بسهولة. علاوة على ذلك ، يمكن تطبيق خطوات الحقن الوريدي المذكورة هنا على مجموعة واسعة من الحقن التي يجب إعطاؤها عن طريق الوريد ، مثل oligonucleotides المضادة للحساسية (ASOs) ، مع إجراء التعديلات المناسبة على خطوات تحضير الحقن اعتمادا على الحقن.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن يشكروا موظفي مرفق رعاية NINDS على دعمهم. تم دعم هذا العمل من قبل قسم البحوث الداخلية في المعاهد الوطنية للصحة ، NINDS (التقرير السنوي رقم 1ZIANS003129). المحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| 0.22 µm syringe filter | Millipore | SLGVM33RS | |
| 0.3 mL insulin syringes with 29G needle | BD Biosciences | 324702 | |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Crystalgen | 23-2051 | |
| 10 mL syringe | BD Biosciences | 302995 | |
| 100% EtOH | The Warner Graham Company | 201096 | |
| 10x phosphate-buffered saline (PBS) | Corning | 46-013-CM | Used to prepare 1x PBS for tissue fixation |
| 15 mL conical tube | Corning | 430766 | |
| 15 mL conical tube holder | Multiple sources | N/A | |
| 190 proof ethyl alcohol | The Warner Graham Company | 6810-01-113-7320 | Used to prepare 70% ethanol |
| 1x sterile PBS | Gibco | 10010023 | |
| 2 mL microcentrifuge tissue storage tubes | Eppendorf | 022363344 | |
| 4% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 157-4 | |
| Adeno-associated virus (AAV) | Charles River | N/A | Single-stranded DNA (ssDNA) AAV was packaged to deliver Cre recombinase as the transgene driven by CMV promoter |
| Alcohol swab | BD Biosciences | 326895 | |
| Bead lysis tube | Next Advance | GREENE5 | |
| BsuRI (HaeIII) restriction enzyme | Thermo Fisher Scientific | ER0151 | |
| Bullet blender | Next Advance | BBX24B | |
| Ai14-derived mice from JAX 007914 strain (genetic background: C57BL/6J) | N/A | N/A | Mice containing Ai14 Cre-reporter allele were purchased from JAX (catalog number: 007914) |
| Disposable absorbent pads | Fisherbrand | 1420662 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools (F.S.T) | 11251-35 | |
| Dissection scissors | Fine Science Tools (F.S.T) | 14085-08 | |
| DNA degradation reagent (DNAZap) | Invitrogen | AM9890 | |
| DNA-Extraction RNase A | Qiagen | 19101 | For RNA digestion during nucleic acid extraction |
| DNase-free RNase for DNA cleanup | F. Hoffmann-La Roche | 11119915001 | For RNA digestion after nucleic acid extraction |
| dPCR Probe PCR Kit | Qiagen | 250102 | |
| dPCR software | Qiagen | N/A | QIAcuity Software Suite |
| Elevated platform | Multiple sources | N/A | An empty pipette tips box was used to elevate the mouse restrainer during tail warming up |
| Fluorescence microscope | Multiple sources | N/A | Model used here: Nikon Eclipse Ti |
| Fluorescence microscope software | Multiple sources | N/A | Software used here: NIS-Elements |
| Gauze | Covidien | 9022 | |
| Heat block | Eppendorf | Thermomixer 5350 | |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 22620689 | |
| Metal container | Vollrath | 80125 | |
| Methylbutane | J.T. Baker | Q223-08 | |
| Molecular grade water | Quality Biological | 351-029-131 | |
| Mouse tube restrainer | Braintree Scientific | TV-RED-150-STD | |
| Myfuge mini centrifuge | Benchmark Scientific | C1012 | |
| Polymerase chain reaction thermal cycler | Bio-Rad Laboratories | 1851148 | Model: C1000 Touch |
| Precision wipes | Kimberly-Clark Professional | 7552 | |
| Proteinase K | Qiagen | 19131 | |
| QIAcuity dPCR Nanoplate 26k 24-well | Qiagen | 250001 | |
| QIAcuity One dPCR system | Qiagen | 911020 | |
| Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | Used for DNA extraction from tissues |
| Qiagen QIAamp DNA Micro Kit | Qiagen | 56304 | Used for cleanup of genomic DNA, and the isolation of DNA from small volumes of blood prtocotol was used for DNA extraction from FACS-sorted cells |
| Rodent restrainer cone | Braintree Scientific | MDC-200 | |
| Scale | Ohaus | 72212663 | |
| Styrofoam box | Multiple sources | N/A | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378-1kg | |
| Surface cleaner and disinfectant | Peroxigard | 29101 | |
| Timer | Multiple sources | N/A | |
| Transfer forceps | Fine Science Tools (F.S.T) | 91113-10 | |
| Vortex | Daigger & Company | 22220A | Model: Daigger Vortex Genie 2 |
References
- Tisdale, A., et al. The ideas initiative: Pilot study to assess the impact of rare diseases on patients and healthcare systems. Orphanet J Rare Dis. 16 (1), 429 (2021).
- Condo, I. Rare monogenic diseases: Molecular pathophysiology and novel therapies. Int J Mol Sci. 23 (12), 6525 (2022).
- Vaisitti, T., et al. The frequency of rare and monogenic diseases in pediatric organ transplant recipients in italy. Orphanet J Rare Dis. 16 (1), 374 (2021).
- Bulcha, J. T., Wang, Y., Ma, H., Tai, P. W. L., Gao, G. Viral vector platforms within the gene therapy landscape. Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 53 (2021).
- Lundstrom, K. Viral vectors in gene therapy: Where do we stand in 2023. Viruses. 15 (3), 698 (2023).
- Wang, C., et al. Emerging non-viral vectors for gene delivery. J Nanobiotechnology. 21 (1), 272 (2023).
- Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. Adeno-associated virus (aav) as a vector for gene therapy. BioDrugs. 31 (4), 317-334 (2017).
- Ghosh, S., Brown, A. M., Jenkins, C., Campbell, K. Viral vector systems for gene therapy: A comprehensive literature review of progress and biosafety challenges. Appl Biosaf. 25 (1), 7-18 (2020).
- Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nat Rev Drug Discov. 18 (5), 358-378 (2019).
- Srivastava, A. Rationale and strategies for the development of safe and effective optimized aav vectors for human gene therapy. Mol Ther Nucleic Acids. 32, 949-959 (2023).
- Mukherjee, P., Roy, S., Ghosh, D., Nandi, S. K. Role of animal models in biomedical research: A review. Lab Anim Res. 38 (1), 18 (2022).
- Jucker, M. The benefits and limitations of animal models for translational research in neurodegenerative diseases. Nat Med. 16 (11), 1210-1214 (2010).
- Vandamme, T. F. Use of rodents as models of human diseases. J Pharm Bioallied Sci. 6 (1), 2-9 (2014).
- Anders, H. J., Vielhauer, V. Identifying and validating novel targets with in vivo disease models: Guidelines for study design. Drug Discov Today. 12 (11-12), 446-451 (2007).
- Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider. J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (5), 600-613 (2011).
- Prabhakar, S., Lule, S., Da Hora, C. C., Breakefield, X. O., Cheah, P. S. Aav9 transduction mediated by systemic delivery of vector via retro-orbital injection in newborn, neonatal and juvenile mice. Exp Anim. 70 (4), 450-458 (2021).
- Hauff, P., Nebendahl, K., Kiessling, F., Pichler, B. J., Hauff, P. Drug administration. Small Animal Imaging: Basics and Practical. , 127-152 (2017).
- Saleem, M., et al. A new best practice for validating tail vein injections in rat with near-infrared-labeled agents. J Vis Exp. (146), (2019).
- Resch, M., Neels, T., Tichy, A., Palme, R., Rulicke, T. Impact assessment of tail-vein injection in mice using a modified anaesthesia induction chamber versus a common restrainer without anaesthesia. Lab Anim. 53 (2), 190-201 (2019).
- Glascock, J. J., et al. Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (icv) and intravenous (iv) injection in mice. J Vis Exp. (56), 2968 (2011).
- Grames, M. S., Jackson, K. L., Dayton, R. D., Stanford, J. A., Klein, R. L. Methods and tips for intravenous administration of adeno-associated virus to rats and evaluation of central nervous system transduction. J Vis Exp. (126), 55994 (2017).
- Yano, J., Lilly, E. A., Noverr, M. C., Fidel, P. L. A contemporary warming/restraining device for efficient tail vein injections in a murine fungal sepsis model. J Vis Exp. (165), 61961 (2020).
- Warren, J. S. A., Feustel, P. J., Lamar, J. M. Combined use of tail vein metastasis assays and real-time in vivo imaging to quantify breast cancer metastatic colonization and burden in the lungs. J Vis Exp. (154), 60687 (2019).
- JoVE Science Education Database. . Lab Animal Research. Compound administration I. , (2023).
- UCSF Office of Research, Institutional Animal Care and Use Program. Lateral tail vein injection in mice and rats (preferred technique for vascular access in mice Available from: https://iacuc.ucsf.edu/sites/g/files/tkssra751/f/wysiwyg/STD%20PROCEDURE%20-%20Misc%20Rodent%20Procedures%20-%20Lateral%20Tail%20Vein%20Injection%20in%20Mice%20and%20Rats.pdf (2023)
- Jones, K. Tail vein injections in the mouse and rat sop. UBC Animal Care Guidelines SOP: ACC-2012-Tech03. , (2012).
- Liadaki, K., Luth, E. S., Kunkell, L. M. Co-detection of gfp and dystrophin in skeletal muscle tissue sections. Biotechniques. 42 (6), 699-700 (2007).
- Burr, A., et al. Allometric-like scaling of aav gene therapy for systemic protein delivery. Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 368-379 (2022).
- Lang, J. F., Toulmin, S. A., Brida, K. L., Eisenlohr, L. C., Davidson, B. L. Standard screening methods underreport aav-mediated transduction and gene editing. Nat Commun. 10 (1), 3415 (2019).
- Rodriguez-Estevez, L., Asokan, P., Borras, T. Transduction optimization of aav vectors for human gene therapy of glaucoma and their reversed cell entry characteristics. Gene Ther. 27 (3-4), 127-142 (2020).
- Hatakeyama, S., Yamamoto, H., Ohyama, C. Tumor formation assays. Methods Enzymol. 479, 397-411 (2010).
Tags
This article has been published
Video Coming Soon
Keep me updated:
.
Cite This Article
Guirguis, F., Bolduc, V., Slarve, M. J., Zhou, H., Muntoni, F., Bönnemann, C. G. Consistent Delivery of Adeno-Associated Virus via Lateral Tail-Vein Injection in Adult Mice. J. Vis. Exp. (210), e66934, doi:10.3791/66934 (2024).