Utilizzo di oligonucleotidi sintetici modificati per il dosaggio degli enzimi che metabolizzano gli acidi nucleici

Tutte le forme di vita richiedono enzimi di elaborazione dell’acido nucleico per eseguire processi biologici fondamentali, tra cui la replicazione, la trascrizione e la riparazione del DNA. Le principali funzionalità enzimatiche per queste vie sono le polimerasi, che generano copie di molecole di RNA/DNA, le ligasi che si uniscono ai substrati polinucleotidici, le nucleasi che le degradano, e le elicasi e le topoisomerasi, che fondono duplex di acidi nucleici o ne modificano la topologia 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Inoltre, molti di questi enzimi forniscono strumenti molecolari essenziali per applicazioni come il clonaggio, la diagnostica e il sequenziamento ad alto rendimento 11,12,13,14,15.

Le caratteristiche funzionali, la cinetica e le specificità del substrato di questi enzimi possono essere determinate utilizzando substrati di DNA/RNA marcati prodotti mediante ricottura di oligonucleotidi. Il tracciamento dei substrati e dei prodotti è stato tradizionalmente ottenuto introducendo un’etichetta radioattiva (³²P) all’estremità del filamento 5′, che può quindi essere rilevata da una pellicola fotografica o con un sistema di imaging al fosforo^16,17. Mentre i substrati radiomarcati offrono il vantaggio di una maggiore sensibilità sperimentale e non alterano le proprietà chimiche di un nucleotide, i potenziali rischi per la salute derivanti dal lavoro con i radioisotopi hanno incoraggiato lo sviluppo di marcature di acidi nucleici non radioattivi per fornire un’alternativa più sicura per la rilevazione di DNA e RNA 18,19,20. Tra questi, il rilevamento della fluorescenza, incluso il rilevamento diretto della fluorescenza, la fluorescenza risolta nel tempo e i saggi di trasferimento di energia/estinzione della fluorescenza si distinguono come i più versatili 21,22,23,24. L’ampia gamma di fluorofori consente diversi design di substrati di DNA/RNA con reporter unici su ciascun oligonucleotide²⁵. Inoltre, la stabilità dei fluorofori, rispetto ai radioisotopi, consente agli utenti di produrre e conservare quantità significative di substrati di DNA marcati in fluorescenza¹⁹. Questi substrati marcati con fluorofori possono essere incubati con la proteina di interesse, insieme a diverse combinazioni di cofattori metallici e nucleotidici, per analizzare il legame e/o l’attività enzimatica. La visualizzazione del legame o dell’attività può essere osservata utilizzando vari canali di coloranti fluorofori con un sistema di imaging su gel. Poiché con questa tecnica saranno visibili solo gli oligonucleotidi marcati in fluorescenza, qualsiasi aumento o diminuzione delle dimensioni dell’oligonucleotide marcato sarà facile da seguire. I gel possono anche essere colorati in seguito, con coloranti coloranti per acidi nucleici per visualizzare tutte le bande di DNA presenti sul gel.

Le ligasi degli acidi polinucleici sono enzimi che uniscono frammenti di DNA/RNA, catalizzando la sigillatura delle rotture mediante la formazione di un legame fosfodiestere tra i terminali del DNA fosforilato 5′ e l’OH 3′ del DNA. Possono essere divisi in due gruppi in base al loro requisito di substrato nucleotidico. Le ligasi NAD-dipendenti altamente conservate si trovano in tutti i batteri²⁶, mentre gli enzimi ATP-dipendenti, strutturalmente diversi, possono essere identificati in tutti i domini della vita ^8,27. Le DNA ligasi svolgono un ruolo importante nell’elaborazione dei frammenti di Okazaki durante la replicazione, oltre ad essere coinvolte in varie vie di riparazione del DNA, come la riparazione per escissione di nucleotidi e basi, attraverso la sigillatura di intaccature spontanee e intaccature che rimangono dopo la riparazione ^8,10. Diverse DNA ligasi mostrano diverse capacità di unire diverse conformazioni di rotture del DNA, tra cui intaccature in un duplex, rotture a doppio filamento, disallineamenti e lacune, nonché ibridi di RNA e DNA 28,29,30. Una vasta gamma di substrati legabili può essere assemblata mediante ricottura di oligonucleotidi con un fosfato 5′ per generare termini 5′ e 3′ giustapposti in un duplex di acido nucleico 31,32,33. Il metodo di analisi più comune è la risoluzione mediante urea PAGE in un formato di saggio end-point; Tuttavia, le recenti innovazioni hanno incluso l’uso dell’elettroforesi su gel capillare, che consente un’elevata produttività³⁴, la profilazione spettrometrica di massa³⁵, nonché un saggio beacon molecolare omogeneo, che consente il monitoraggio risolto nel tempo³⁶.

Il primo passo in una reazione di legatura è l’adenilazione dell’enzima ligasi da parte dell’adenosina trifosfato (ATP) o della nicotinammide adenina dinucleotide (NAD), risultando in un intermedio enzimatico covalente. Il secondo passo della reazione è l’adenilazione del substrato dell’acido nucleico all’estremità 5′ del sito di nick, che è seguita dalla legatura dei filamenti di nick dell’acido nucleico. Molti enzimi ligasi che sono espressi in modo ricombinante in E. coli sono purificati nella forma adenilata e, quindi, sono in grado di legare con successo gli acidi nucleici senza l’aggiunta di un cofattore nucleotidico. Ciò rende difficile determinare quale particolare tipo di cofattore nucleotidico sono necessari per la legatura degli acidi nucleici. Oltre a descrivere i saggi per valutare l’attività della DNA ligasi, viene presentato anche un metodo per determinare in modo affidabile l’uso del cofattore de-adenilando l’enzima utilizzando substrati non marcati.

Le nucleasi sono un gruppo ampio e diversificato di enzimi che modificano il DNA/RNA e RNA catalitici che scindono i legami fosfodiestere tra gli acidi nucleici³⁷. Le funzionalità dell’enzima nucleasi sono necessarie nella replicazione, riparazione e processazione dell’RNA del DNA e possono essere classificate in base alla loro specificità zuccherina per DNA, RNA o entrambi. Le endonucleasi idrolizzano i legami fosfodiestere all’interno di un filamento di DNA/RNA, mentre le esonucleasi idrolizzano i filamenti di DNA/RNA un nucleotide alla volta dall’estremità 3′ o 5′ e possono farlo sia dall’estremità 3′ a 5′ che da 5′ a 3′ del DNA³⁸.

Mentre molte proteine nucleasi sono aspecifiche e possono essere coinvolte in più processi, altre sono altamente specifiche per una particolare sequenza o danno al DNA ^6,39,40. Le nucleasi sequenza-specifiche sono utilizzate in un’ampia gamma di applicazioni biotecnologiche, come la clonazione, la mutagenesi e l’editing del genoma. Le nucleasi popolari per queste applicazioni sono le nucleasi di restrizione⁴¹, le nucleasi a dita di zinco⁴², le nucleasi effettrici simili ad attivatori trascrizionali e, più recentemente, le nucleasi CRISPR ingegnerizzate guidate dall’RNA⁴³. Recentemente sono state identificate nucleasi danno-specifiche, come la nucleasi EndoMS, che ha specificità per i mismatch nel DNA attraverso il suo dominio ^5,44 della nucleasi RecB-like mismatch-specific. I saggi di attività nucleasica, storicamente, sono stati eseguiti come saggi discontinui con substrati radiomarcati; Tuttavia, oltre agli altri inconvenienti, questi non consentono l’identificazione del sito che viene tagliato da una proteina nucleasi, cosa possibile quando si utilizzano substrati marcati in fluorescenza ^45,46. Più recentemente, sono stati sviluppati saggi di nucleasi continua che funzionano utilizzando diversi coloranti di DNA che interagiscono con il DNA in stati diversi; ad esempio, emettendo un segnale fluorescente più elevato quando interagisce con il dsDNA rispetto al suo stato non legato, o legandosi specificamente a RNA corti⁴⁷. Altri saggi di nucleasi continua utilizzano forcine di DNA con un gruppo fluoroforo sul 5′ e un quencher sull’estremità 3′ in modo che la fluorescenza aumenti man mano che l’oligonucleotide viene degradato a causa di una separazione del fluoroforo e del quencher⁴⁸. Sebbene questi saggi consentano di caratterizzare la cinetica delle proteine che degradano il DNA, richiedono una conoscenza preliminare della funzione e del substrato dell’enzima e sono anche limitati agli enzimi che modificano la conformazione del DNA per causare una differenza nel legame del colorante. Per questo motivo, i saggi endpoint che risolvono i singoli prodotti nucleasici sono ancora auspicabili per fornire informazioni sulle modifiche del DNA causate dall’attività proteica.

Qui, viene presentata una procedura dettagliata per la progettazione di oligonucleotidi DNA/RNA marcati in fluorescenza che possono essere miscelati e abbinati per generare substrati per testare l’attività di nuovi enzimi nucleasi, polimerasi e ligasi. La convalida di questo set di base di sequenze oligonucleotidiche semplifica la progettazione sperimentale e facilita la profilazione economica di un’ampia gamma di funzionalità enzimatiche senza la necessità di acquistare un gran numero di substrati su misura. Viene fornita una procedura dettagliata per l’esecuzione di un saggio enzimatico standard di elaborazione del DNA con questi substrati, utilizzando l’esempio dell’attività della DNA ligasi e vengono descritte le modifiche per il saggio e l’analisi degli enzimi nucleasi e polimerasi. Inoltre, viene fornito un test modificato per determinare la specificità del cofattore dell’enzima DNA ligasi con elevata precisione e vengono utilizzate sonde a doppia marcatura per valutare l’assemblaggio di legature multicomponente. Infine, vengono discusse le modifiche al formato del saggio di base per consentirne l’utilizzo per determinare le interazioni proteina-DNA con gli stessi substrati mediante il saggio di spostamento della mobilità elettroforetica (EMSA).