Histoflow Sitometri ile Yüksek Parametreli Histoloji Görüntülerinin Oluşturulması ve Analiz Edilmesi

Bağışıklık sistemi hücreleri ve glial hücreler tarafından yönlendirilen iltihaplanma, her bir popülasyonun diğer ^1,2,3’ün aktivitesini teşvik edebileceği CNS’nin kronik bozukluklarına katkıda bulunabilir. Bağışıklık sisteminin, CNS inflamasyonunu teşvik etmek için CNS’nin bu unsurları ile nasıl etkileşime girdiğini anlamak şu anda önemli bir ilgi konusudur ve tek hücreli RNA dizilimi gibi yüksek parametreli tekniklerle büyük ölçüde kolaylaştırılmıştır. Tek hücreli RNA dizilimi sayesinde, çeşitli CNS bozukluklarında^glial hücreler ve bağışıklık sistemi arasında geniş bir iletişim olduğunu keşfettik ^4,5,6. Bu etkileşimlerin bu bozuklukları nasıl etkilediğini anlamak, bu hastalıkların biyolojisini aydınlatmak için çok önemli olacaktır.

Tek hücreli dizileme analizleriyle ilgili bir sorun, bu tekniklerin tek hücreler veya çekirdekler elde etmek için dokunun bozulmasını gerektirmesi ve bunun da tam bir uzamsal bilgi kaybına neden olmasıdır. Bir hücrenin bir dokuda nerede bulunduğunu bilmek, hücrenin iltihabı yönlendirmedeki rolünü anlamak için kritik öneme sahiptir. Örneğin, B hücreleri gibi bağışıklık hücreleri, nöroinflamasyon sırasında CNS’de konsantre olabilir; bununla birlikte, nadiren CNS parankimine girerler ve bunun yerine CNS bariyerlerine⁷ konsantre olurlar. Lokalizasyonları göz önüne alındığında, bu hücrelerin CNS parankimindeki glial hücrelerle fiziksel olarak etkileşime girerek CNS inflamasyonuna katkıda bulunmaları olası değildir, bu da glial hücrelerle sahip olabilecekleri herhangi bir etkileşimin salgılanan faktörler yoluyla gerçekleşeceğini düşündürür. Ek olarak, CNS bozukluklarında ortaya çıkan patoloji genellikle ^8,9 yapısına sahiptir, öyle ki bir hücrenin dokudaki lokalizasyonu, bozukluğa aktif olarak katkıda bulunup bulunmadığını veya bir seyirci olup olmadığını kritik olarak belirleyebilir. Bu nedenle, bir hücrenin patolojideki rolünü değerlendirmek için uzamsal yönelimin kullanılması esastır.

Dokudaki hücrelerin incelenmesi tipik olarak immünohistokimya veya immün floresan mikroskobu kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu tekniklerle ilgili bir sorun, tipik olarak aynı anda en fazla dört parametreyi görüntüleyebilmeleridir. Akış sitometrisi ve tek hücreli RNA dizileme analizlerinden bildiğimiz gibi, birçok hücre popülasyonunun tanımlanması için iki veya daha fazla parametreye ihtiyaç duyduğunu bildiğimiz için, bu teknikler için önemli bir sınırlamadır; Ayrıca, bir hücre tipi^10’un belirli alt kümelerini ararken gereken parametrelerin sayısı tipik olarak artar. Bu nedenle, hücre alt kümelerinin bir doku içinde nasıl etkileşime girebileceğini incelemek için standart görüntüleme tekniklerini kullanmak pratik değildir.

Bu sorun, uzamsal RNA dizilimi¹¹ ve görüntüleme kütle sitometrisi¹² gibi uzamsal bilgileri koruyabilen daha yeni yüksek parametreli yöntemlerle kısmen aşılmıştır. Bu teknikler değerli olsa da, yaygın olarak bulunamama, üç boyutlu verileri iki boyuta indirgeme ve yürütme konusunda önemli uzmanlık gerektirme gibi çeşitli sorunları vardır. Dokuların bir antikor seti ile boyandığı ve ardından başka bir antikor seti ile boyanmadan önce önceki antikor setinin inaktive edildiği sıralı boyama olarak bilinen başka bir teknik, özel ekipman veya uzmanlığa ihtiyaç duymadan yüksek parametreli histoloji elde edebilir 13,14,15. Bununla birlikte, sıralı boyama son derece emek yoğun olabilir ve büyük miktarda mikroskopi süresi gerektirir, bu da kişisel mikroskobu olmayan laboratuvarlar için pratik olmayabilir. Bu nedenle, yaygın olarak bulunan mikroskoplarda bir seferde görüntülenebilen floresan parametrelerinin sayısını ve zamanında genişletilebilen tekniklere ihtiyaç vardır.

Yüksek parametreli veriler elde edildikten sonra, başka bir sorun ortaya çıkar: geleneksel görüntü analizi yöntemlerinin verileri başarılı bir şekilde analiz etmesi pek olası değildir. Manuel sayma veya eşikleme gibi teknikler, yalnızca analiz tek bir parametreden oluşuyorsa veya yalnızca çakışan sinyallerin sayıldığı birden fazla işaretleyici aynı lokalizasyona sahipse geçerlidir. Bu sınırlama, geleneksel analizi yüksek parametreli veri kümeleriyle çalışmak için yetersiz hale getirir. Bu veri kümelerinin başarılı analizi, histoloji görüntülerinden tek hücrelerin bölümlere ayrılması ve ardından hücre tiplerini tanımlamak için akış sitometrisi benzeri geçit stratejileri yürütülmesiyle elde edilmiştir^16,17. Bununla birlikte, bu analizleri etkileyen bir diğer konu da, yalnızca ilgilenilen tüm hücrelerin fiziksel olarak birbirinden ayrıldığı veri kümeleri için çalışmalarıdır, çünkü bu teknikler fiziksel temas halinde olan hücreleri doğru bir şekilde ayırabilecek yöntemler kullanmaz. Bu nedenle, hücreler fiziksel temas halinde olsa bile histoloji kesitleri üzerinde tek hücreli analizler yapabilen daha yeni bir yöntem gereklidir.

Bu makalede, daha önce tanıtılan^{ve yaygın olarak bulunan mikroskoplar} kullanılarak aynı anda görüntülenebilen floresan parametrelerinin sayısını genişleten histoflow sitometri adı verilen basit bir protokol açıklanmaktadır 18. Bu protokol, dokuları spektral olarak örtüşen boyalarla boyayarak ve daha sonra net tek lekeler elde etmek için üst üste binen kanallardan kanamayı gidermek için spektral kompanzasyon kullanarak çalışır. Yüksek parametreli histoloji görüntülerinin analizini kolaylaştırmak için, akış sitometrisi benzeri geçit stratejileri kullanarak hücreleri farklı popülasyonlara ayırmak amacıyla doku bölümlerinden tek hücreleri çıkaran ayrıntılı bir analiz hattı açıklanmaktadır. Bu protokol, hücrelerin yaygın olarak bulunduğu dokularda ve hücrelerin birbirine sıkı sıkıya sıkıştırıldığı dokularda çalışır ve bu tekniği hem homeostaz hem de nöroinflamasyonda CNS gibi dokuların incelenmesi için çok yönlü hale getirir. Bu nedenle, histoflow sitometri, uzamsal bilgileri korurken hücreleri tanımlamak için birden fazla hücre işaretleyicisi gerektiren karmaşık hücre tipleri arasındaki etkileşimleri incelemek için yararlı bir tekniktir.