בידוד תאי דם חד-גרעיניים היקפיים אנושיים ממעילי באפי באמצעות הפרדת חרוזים אימונומגנטית בתפוקה גבוהה
Summary
פרוטוקול זה מפרט שיטה תואמת אוטומציה בתפוקה גבוהה לבידוד תאי דם חד-גרעיניים היקפיים אנושיים למטרות ביו-בנקאות ולמטרות אחרות.
Abstract
תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs) הם אוכלוסייה הטרוגנית של מונוציטים ולימפוציטים. למרכזיות בהקפאה יש יכולת קיום יציבה באחסון לטווח ארוך, מה שהופך אותן לסוג תא אידיאלי למטרות מחקר רבות במורד הזרם, כולל ציטומטריית זרימה, בדיקות חיסוניות וריצוף גנום. בדרך כלל, PBMCs מבודדים באמצעות צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות, עם זאת, זהו תהליך עבודה בתפוקה נמוכה שקשה ויקר לשנות את קנה המידה. מאמר זה מציג זרימת עבודה בעלת תפוקה גבוהה באמצעות שיטת בידוד PBMC מבוססת חרוזים מגנטיים הניתנת ליישום במהירות. ריכוז התאים הכולל, הכדאיות ופיזור האוכלוסייה עם PBMCs שהתקבלו באמצעות בידוד שיפוע צפיפות הושוו, ויכולת קיום התאים וחלקם היחסי של סוגי התאים היו דומים בשתי הטכניקות. מרכזיות מבודדות הדגימו יכולת קיום של מעל 70% עד 9 ימים לאחר איסוף הדם, אם כי התפוקה ירדה בחצי לאחר 5 ימים בהשוואה למרכזיות שעובדו תוך 24 שעות מהאיסוף. לסיכום, מאמר זה מתאר פרוטוקול PBMC המשתמש בגישה מבוססת חרוזים כדי להסתגל לזרימת עבודה בתפוקה גבוהה ומדגים כי שיטות ידניות ואוטומטיות מבוססות חרוזים יכולות להגדיל את קיבולת העיבוד ולספק גמישות לתקציבים שונים.
Introduction
בידוד תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMC) היא טכניקה המפרידה ומבודדת לימפוציטים ומונוציטים ממרכיבי דם שלמים אחרים. PBMCs הם סוג תא רב-תכליתי המשמש ליישומים רבים, כולל, אך לא רק, אימונותרפיה, פיתוח חיסונים, זיהוי מטרה או סמנים ביולוגיים, ופיתוח תרופות נוגדנים/מולקולות קטנות 1,2. תאים אלה עשויים להיות מבודדים מאנשים בריאים או חולים וניתן להשתמש בהם באופן מיידי בתהליכים במורד הזרם או בהקפאה למחקר עתידי3. במקרים מסוימים, המטרה במורד הזרם ידועה, בעוד שבמקרים אחרים, כפי שמקובל בביו-בנקאות, PBMCs מבודדים ומאוחסנים עבור יישומים עתידיים שלא צוינו4.
צנטריפוגת שיפוע צפיפות היא הטכניקה המסורתית לבידוד PBMCs 5,6,7 מדם שלם, תוך שימוש בהפרדה דיפרנציאלית של סוגי התאים המרכיבים בהתבסס על צפיפות התאים במהלך הצנטריפוגה. אמנם ייתכנו שינויים מסוימים בשיטה זו, דם שלם בדרך כלל מדולל במי מלח חוצצי פוספט (PBS), שכבות על מדיום שיפוע צפיפות בצינור צנטריפוגה מיוחד או סטנדרטי, ולאחר מכן מסובב. התוצאה היא ארבע שכבות נפרדות: שכבת הפלזמה העליונה מועשרת בטסיות דם, שכבת PBMC דקה נמצאת מעל מדיום שיפוע הצפיפות, ולבסוף, השכבה התחתונה מורכבת מכדוריות דם אדומות (RBCs) וגרנולוציטים. אף על פי ששיטה זו כונתה בעבר “תקן הזהב”8, ישנן מגבלות להתרחבות, כגון זמן עיבוד ממושך, קיבולת צנטריפוגות, קושי בציטוט מוצרי דם אחרים (כלומר, פלזמה ו- RBCs), ולהיות מייגע לאוטומציה. בעוד אוטומציה אפשרית עבור שיטהזו 9, היא דורשת תכנות מקיף של מטפל נוזלים (עם מודול צנטריפוגה להיות אוטומטי לחלוטין) ויישאר תהליך ארוך.
מעתה, מוצג תהליך עבודה חלופי המשתמש בהפרדת חרוזים אימונומגנטית עם מגנט בעל שמונה מחזיקים לעיבוד ידני או מכשיר לעיבוד אוטומטי לחלוטין. שיטה זו משתמשת בקוקטייל נוגדנים המוסף לתאים וקושר אוכלוסיות תאים לא רצויות, במקרה זה טסיות דם, גרנולוציטים ו-RBC. אוכלוסיות לא רצויות אלה מוסרות לאחר מכן על ידי הפרדה מגנטית, ומשאירות אוכלוסיות מונוציטים ולימפוציטים בחלק השלילי המוכנות לעיבוד במורד הזרם10. שיטת ברירה שלילית זו מהירה יותר משיטות ברירה חיובית הדורשות צעדים נוספים להסרת קומפלקס הנוגדנים והחרוזים המגנטיים מהמרכזיות. ברירה שלילית היא יתרון נוסף מכיוון שהיא תוארה כדרך לשמר את פונקציונליות התא11,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
PBMCs אנושיים הם סוגי תאים רב-תכליתיים המשמשים לבדיקות רבות; עם זאת, תפוקת בידוד היא לעתים קרובות מגבלה במעבדות רבות, כולל ביובנקים16. בעבר, ה- NSW Health Statewide Biobank בודד PBMCs באמצעות שיטת שיפוע הצפיפות. אוטומציה נחקרה עבור שיטת הפרדת שיפוע צפיפות כדי להגדיל את קיבולת העיבוד, אך זוהו חסמים ליישום, כולל (i) העלות של מטפל בנוזלים עם יחידת צנטריפוגה להיות אוטומטית לחלוטין, עם דרישה נוספת ליחידת HEPA לייצר מוצר סטרילי, (ii) כוח אדם מיומן לתכנות, ו (iii) הזמן הדרוש לבדיקת פרוטוקול. לכן, מחקר זה בחן שיטות חלופיות וזיהה את ערכת PBMC האנושית שהושגה באופן מסחרי שיכולה לשמש לעיבוד ידני ואוטומטי. סטריליות מובטחת מכיוון שהציוד הדרוש לעיבוד מתאים לארון בטיחות ביולוגי סטנדרטי (אורך של 1.2 מטר). מאמר זה מפרט שינויים שבוצעו בפרוטוקול14 המומלץ של היצרן, כדי להגביר את היעילות ולהוזיל את עלויות המגיבים מבלי להקריב את האיכות. בנוסף, פרוטוקול היצרן הורחב כדי לפרט צעדים לדגימות ביובנק למחקר עתידי, כולל דם שלם (שלב 1.2), פלזמה (שלב 2.2) ו- RBC (שלב 2.5) היוצא מצינורית הדם המקורית, כמו גם ספירת תאים ושימור בהקפאה.
במחקר זה הושוו שלושה פרוטוקולי בידוד PBMC: הפרדת שיפוע צפיפות, בידוד ידני ואוטומטי מבוסס חרוזים. בוצעו שינויים בפרוטוקול מבוסס החרוזים הידני של היצרן, כולל הסרת דילול מעיל באפי לפני בידוד PBMC, וביטול הדרישה לניתוק OFF לצנטריפוגציות, מה שמאפשר לחוקרים לעקוב אחר פרוטוקול בידוד PBMC הניתן להתאמה, חסכוני ובתפוקה גבוהה. ראשית, שמונה דגימות דם שלמות תואמות שימשו לבידוד PBMCs כדי להשוות את הפרדת שיפוע הצפיפות וטכניקה ידנית מבוססת חרוזים. חשוב לציין שהתפלגות אוכלוסיית התאים, כדאיות התאים וההתאוששות של PBMCs לא היו שונים באופן משמעותי בין שתי השיטות שהושוו, כפי שניתן לראות באיור 2A-F, איור 3A ואיור משלים 1, בהתאמה. בנתונים המייצגים, ספירת התאים הייתה גבוהה יותר בשיטת הפרדת שיפוע הצפיפות בשיטת ההדרה הכחולה של טריפאן, אך לא כאשר נעשה שימוש במנתח תאים המטולוגי. הגדרות סוג התא PBMC על מונה התא השתמשו בטווח קוטר התא של 8-50 מיקרומטר, ולכן הספירה תכלול PBMCs כמו גם גרנולוציטים (בקוטר 12-15 מיקרומטר בקירוב) בעת שימוש בשיטת ההרחקה הכחולה של טריפאן17. בעוד מונה התאים ההמטולוגיים הציע ספציפיות גבוהה יותר מאשר שיטת ההרחקה הכחולה של טריפאן, חלק מחישובי השחזור היו גבוהים מ-100%, מה ששיקף את מרווח הטעות של המכשיר (ראה איור משלים 1). לכן, מומלץ לחוקרים ליישם שילוב של טכניקות ספירת תאים בעת השוואת התפוקה מפרוטוקולי בידוד PBMC, מכיוון שרוב הטכניקות אינן מציעות ספירת תאים דיפרנציאלית ספציפית ורגישה מאוד. יתר על כן, בדיקות לא בוצעו כדי להשוות את הפעילות הפונקציונלית של PBMCs הניבה משתי הטכניקות, וזו מגבלה של הניתוח שלנו.
לאחר מכן, הושוו השיטות הידניות והאוטומטיות המבוססות על חרוזים, ולא זוהו הבדלים משמעותיים בין תפוקת PBMC או כדאיות מ-8 דגימות תואמות (איור 4A,B). אוכלוסיות התאים לא הושוו בנפרד, שכן אותו קוקטייל בידוד נוגדנים שימש בשתי השיטות. חשוב לציין שהזמן המעשי לעיבוד 8 דגימות הופחת מ-43 דקות ל-22 דקות באמצעות הפרוטוקול האוטומטי (איור 4C). בעוד התפוקה, מניעת שחיקת טכנאים ועקביות עיבוד הדגימות מובטחים באמצעות אוטומציה, עלות הריאגנטים והחומרים המתכלים גבוהה משמעותית פי 3-4 מהשיטה הידנית המבוססת על חרוזים. זאת לאחר ביצוע שינויים בפרוטוקול הייצור לשימוש ב-1 מ”ל מעיל באפי (מנפח דם שלם של 10 מ”ל) במקום בטווח המומלץ של 2-5 מ”ל (מנפח דם שלם של 10 מ”ל ומעלה). אם התקציב הוא מגבלה, בחירה בשיטה הידנית יכולה להפחית את זמן העיבוד ב~ 25% תוך שמירה על עלויות מגיב ומתכלות דומות לאלה של שיטת הפרדת הצפיפות. מומלץ לעבד לא יותר מ-8 דגימות בכל פעם לכל טכנאי כדי להבטיח התאמה מספקת של הדגימות (~30 שניות לדגימה) בתוך תקופות הדגירה של 5 דקות (שלבים 3.7, 3.11 ו-3.14).
הן בשיטות הידניות והן בשיטות האוטומטיות המבוססות על חרוזים, הסרת מעיל באפי היא צעד קריטי להבטחת בידוד PBMC אופטימלי. חשוב לציין כי בפרוטוקול זה נעשה שימוש במעיל באפי ולא בדם שלם מכיוון שנפח הריאגנטים מבוסס על נפחי חומר התחלתי10. הסרה יעילה של כל נפח מעיל באפי יכולה להיות מאתגרת מבחינה טכנית. בתחילה, שיטה זו פירטה הסרת 0.5 מ”ל מעיל באפי, אולם הוא הוגדל ל 1 מ”ל כדי לשפר את ההתאוששות. כדי להבטיח התאוששות נאותה ועקבית של מעיל באפי, פירוט תהליך זה חשוב בתיעוד פרוטוקול והדרכה. מומלץ לסובב קצה פיפטה תוך כדי שאיפת הפרווה הבוהקת תוך הקפדה לא לשאוף יותר מדי RBCs מהשכבה שמתחתיה (שלב 2.3). חשוב לא להרוות את קוקטייל הנוגדנים הקושר תאים לא רצויים (גרנולוציטים ותאי דם אדומים), מה שעלול להשפיע על היבול והטוהר10. כדי למזער RBCs שנאספו במהלך מיצוי מעיל הבאפי, קצה פיפטה צריך להיות בין שכבת הפלזמה לשכבת הפרווה הבאפי. נפח מעיל באפי ניתן להגדיל מ 1 מ”ל; עם זאת, יש להקפיד כמתואר לעיל כדי להבטיח שלא יותר מ -10% מהנפח שנאסף מכיל RBCs. לחלופין, ניתן להשתמש במטפל אוטומטי בנוזלים כדי לאסוף מעילי באפי באופן עקבי18. עם זאת, השעות הייעודיות הנדרשות לכיול ופתרון בעיות בפרוטוקולי מכשירים לטיפול בנוזלים, במיוחד בהתחשב בהוצאה, עשויות שלא להיות ריאליות עבור רוב המעבדות.
המעבר והיישום של פרוטוקול מבוסס חרוזי אוטומציה היה חיוני בהתחשב במטרתו של NSW Health Statewide Biobank לעבד 23,000 PBMCs במהלך 3 השנים הבאות. כאן, הוכח כי PBMCs ניתן לבודד צינורות ACD עד 9 ימים מהאיסוף עם כדאיות ממוצעת >70%. בעוד שהתפוקות היו אופטימליות 24 שעות לאחר האיסוף, עיבוד במסגרת זמן זו אינו תמיד אפשרי מכיוון שייתכן שיהיה צורך להעביר דגימות. הוכח כי PBMCs שבודדו בשיטה ידנית או אוטומטית המבוססת על חרוזים עשויים להיות בעלי תפוקות של >3 x 105 תאים/מ”ל דם שלם כאשר בודדו תוך 4 ימים מהאיסוף ו->1 x 105 תאים/מ”ל דם שלם כאשר בודדו תוך 10 ימים מהאיסוף. מספרים נמוכים עבור דגימות מעל 5 ימים מצוינים כמגבלה של ניתוח זה. יתר על כן, הנתונים לא הופרדו על בסיס גילאי המשתתפים, מינם וההיסטוריה הקלינית שלהם, מכיוון שמידע זה לא היה זמין. למרות שיש צורך בניתוח השוואתי כדי לבחון את ההשפעות של עיכובים בזמני עיבוד עבור שתי השיטות, דווח בעבר כי עיכובים בבידוד PBMC בשיטת שיפוע הצפיפות מפחיתים את איכות התאים ומגדילים באופן משמעותי את זיהום RBC 19,20. בנוסף, פרופורציות גרנולוציטים גדלות אם העיבוד מתעכב, ולכן יש לקבץ דגימות של “גילאים” דומים לניתוחים במורד הזרם 20,21,22. יש לציין כי ניסוי זה בוצע באמצעות נוגדי קרישה בדם עם דקסטרוז ציטרי חומצי (כלומר, טריסודיום ציטראט, חומצת לימון ודקסטרוז); עם זאת, התפוקה ו / או החלק היחסי של סוגי התאים עשויים להשתנות אם נעשה שימוש בנוגדי קרישה אחרים23; לכן, מומלץ לחוקרים לבחור נוגד קרישה מתאים בהתבסס על ניתוחי PBMC המיועדים במורד הזרם.
לסיכום, מפורט פרוטוקול לבידוד PBMC באמצעות חרוזים מגנטיים הניתנים להתאמה לזרימות עבודה בעלות תפוקה גבוהה כדי למלא את הדרישות לקנה מידה מבלי לפגוע בכדאיות התא. ניתן למטב הן את השיטה הידנית והן את השיטה האוטומטית כדי לייצר ריכוזי תאים ספציפיים על ידי שינוי נפחי ההתחלה וההשעיה. ה- NSW Health Statewide Biobank עבר מחילוץ ~ 60 PBMCs לחודש באמצעות טכניקת הפרדת שיפוע הצפיפות המסורתית ל~ 300 PBMCs לחודש באמצעות שיטה מבוססת חרוזים תואמת אוטומציה זו. המטרה הבאה של המחברים היא להשתמש בפלטפורמה האוטומטית כדי לעבד עד 1200 PBMCs בחודש ולהשוות עוד יותר PBMCs שבודדו הן על ידי טכניקות מבוססות חרוזים מגנטיים (ידניות ואוטומטיות) והן על ידי טכניקות שיפוע צפיפות כדי להנחות את היישום של טכניקה זו למעבדות אחרות עם דגש מיוחד על ביובנקים.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
הביובנק של NSW Health Statewide מודה בהכרת תודה על תמיכתם של NSW Health Pathology, משרד הבריאות והמחקר הרפואי של NSW ומחוז הבריאות המקומי של סידני. בנוסף, המחברים מודים בהכרת תודה לאומיקו ולמחקרים אחרים הנתמכים על ידי NSW Health Statewide Biobank על מתן רשות לפרסם נתונים שנוצרו בתוך החברה ולהשתמש בדגימות שאינן בשימוש למטרות מחקר. המחברים מודים לפרופסור ג’ניפר בריין (NSW Health Pathology, אוניברסיטת סידני) על מנהיגות ביקורתית ודיונים. איור 1 נוצר באמצעות BioRender.com.
Materials
| Cell cryopreservation media CS10, 100 mL (CRYOSTOR) | StemCellTM Technologies | 07930 | |
| Class II Biological Safety Cabinet | Thermo ScientififcTM | 51033311 | |
| CoolCell 1 mL FX | BioTools | BCS-407P | This is the control rate freezing container used. |
| Distilled Water | Bacto Laboratories | 561832 | |
| DxH 500 Hematology Analyzer | Beckman Coulter Life Sciences | B40601 | Referred to as external automated cell counter. |
| EasyEightsTM EasySepTM Magnet | StemCellTM Technologies | 18103 | |
| EasySepTM Direct Human PBMC Isolation Kit | StemCellTM Technologies | 19654 | Kit includes the magnetic bead tube and the cocktail mix tube |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich Pty Ltd | E6758-500G | Instructions to make 0.1M EDTA solution from EDTA salt is located in supplemental file 2. |
| LymphoprepTM Density Gradient Medium | StemCellTM Technologies | 7851 | |
| Megafuge ST4 Plus Centrifuge | Thermo ScientififcTM | THR75009903 | |
| Orion Star A211 pH meter electrode | Thermo ScientififcTM | STARA2110 | |
| Orion™ ROSS Ultra™ Glass Triode™ pH/ATC Combination Electrodes | Thermo ScientififcTM | 8302BNURCA | |
| Phosphate buffered saline (PBS), solution, 1X, 500ml | Life Technologies Australia Pty Ltd | 10010023 | |
| Prism | GraphPad | ||
| RoboSepTM Buffer 1X | StemCellTM Technologies | 20104 | Software used for statistical analysis. |
| RoboSepTM-S | StemCellTM Technologies | 21000 | Fully automated cell separator instrument. |
| RoboSep™ Filter Tips | StemCellTM Technologies | 20125 | |
| SepMateTM-50 (IVD) tubes | StemCellTM Technologies | 85460 | IVD – In vitro diagnostics. Also known as SepMateTM-50 tubes |
| Vi-CELL XR Cell Anlayzer | Beckman Coulter Life Sciences | Internal automated cell counter. Instrument obsolete and no longer available for purchase (as of December 31, 2022). Alternative instrument is the ViCell BLU Cell Viability Analyzer (Product no. C19196). | |
| Vi-CELL XR Quad Pack Reagent Kit | Beckman Coulter Life Sciences | 383722 |
References
- Alexovic, M., et al. Human peripheral blood mononuclear cells: A review of recent proteomic applications. Proteomics. 22 (15-16), e2200026 (2022).
- Zhang, M., Huang, B. The multi-differentiation potential of peripheral blood mononuclear cells. Stem Cell Res Ther. 3 (6), 48 (2012).
- Arimilli, S., Damratoski, B. E., Chen, P., Jones, B. A., Prasad, G. L. Rapid isolation of leukocyte subsets from fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells in clinical research. Cryo Lett. 33 (5), 376-384 (2012).
- Kleeberger, C. A., et al. Viability and recovery of peripheral blood mononuclear cells cryopreserved for up to 12 years in a multicenter study. Clin Diagn Lab Immunol. 6 (1), 14-19 (1999).
- Ulmer, A. J., Scholz, W., Ernst, M., Brandt, E., Flad, H. D. Isolation and subfractionation of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by density gradient centrifugation on percoll. Immunobiology. 166 (3), 238-250 (1984).
- Fuss, I. J., Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Curr Protoc Immunol. 7, 711-718 (2009).
- Gautam, A., et al. Investigating gene expression profiles of whole blood and peripheral blood mononuclear cells using multiple collection and processing methods. PLoS One. 14 (12), e0225137 (2019).
- Hamot, G., Ammerlaan, W., Mathay, C., Kofanova, O., Betsou, F. Method validation for automated isolation of viable peripheral blood mononuclear cells. Biopreserv Biobank. 13 (3), 152-163 (2015).
- Coppola, L., et al. Purification of viable peripheral blood mononuclear cells for biobanking using a robotized liquid handling workstation. J Transl Med. 17 (1), 371 (2019).
- Stemcell Technologies. . 27156, (2020).
- Hornschuh, M., et al. Negative magnetic sorting preserves the functionality of ex vivo cultivated non-adherent human monocytes. Biology (Basel). 11 (11), 1583 (2022).
- Bhattacharjee, J., Das, B., Mishra, A., Sahay, P., Upadhyay, P. Monocytes isolated by positive and negative magnetic sorting techniques show different molecular characteristics and immunophenotypic behaviour. F1000Res. 6, 2045 (2017).
- Ohlsson, S., Diedrich, B., Uhlin, M., Sandgren, P. Optimized processing for pathogen inactivation of double-dose buffy-coat platelet concentrates: Maintained in vitro quality over 7-day storage. Vox Sang. 113 (7), 611-621 (2018).
- Easysep direct human PBMC isolation kit for processing 100 mL buffy coat. Available from: https://www.stemcell.com/products/brands/easysep-cell-separation.html (2022)
- . Vi-cell XR cell viability analyzer instructions for use Available from: https://mbcbiolabs.com/wp-content/uploads/2022/08/Beckman-Coulter-ViCell-Manual.pdf (2017)
- Fuchs, Y. F., et al. Next-generation biobanking: Employing a robotic system for automated mononuclear cell isolation. Biopreserv Biobank. 21 (1), 106-110 (2023).
- Tigner, A., Ibrahim, S. A., Murray, I. V. . Histology, white blood cell. , (2024).
- Mathay, C., Ammerlaan, W., Betsou, F. Automatic buffy coat extract on: Methodology, feasibility, optimization, and validation study. Biopreserv Biobank. 10 (6), 543-547 (2012).
- Golke, T., et al. Delays during PBMC isolation have a moderate effect on yield, but severly compromise cell viability. Clin Chem Lab Med. 60 (5), 701-706 (2022).
- Yi, P. C., et al. Impact of delayed PBMC processing on functional and genomic assays. J Immunol Methods. 519, 113514 (2023).
- Mckenna, K. C., Beatty, K. M., Vicetti Miguel, R., Bilonick, R. A. Delayed processing of blood increases the frequency of activated CD11b+ CD15+ granulocytes which inhibit t-cell function. J Immunol Methods. 341 (1-2), 68-75 (2009).
- Mallone, R., et al. Isolation and preservation of peripheral blood mononuclear cells for analysis of islet antigen-reactive t-cell responses: Position statement of the t-cell workshop committee of the immunology of diabetes society. Clin Exp Immunol. 163 (1), 33-49 (2011).
- Betsou, F., Gaignaux, A., Ammerlaan, W., Norris, P. J., Stone, M. Biospecimen science of blood for peripheral blood mononuclear cell (PBMC) functional applications. Curr Pathobiol Rep. 7 (2), 17-27 (2019).
.