通过高通量免疫磁珠分离从血沉棕黄层中分离人外周血单核细胞

质量控制血液标本和内部生成的数据（例如细胞计数、活力和处理时标本的年龄）来自皇家阿尔弗雷德王子医院新南威尔士州卫生全州生物银行的同意研究（HREC 批准：2019/ETH06776）。在 EDTA 管中收集经过处理（即血浆耗尽）、未筛查和去识别化的成人血液样本。这些质控血液标本在采集后不到 72 小时内进行处理，并用于比较密度梯度和基于磁珠的方法的 PBMC 分离实验。有关代表性结果中使用的密度梯度分离方法，请参见 补充文件 1 中的程序。用于本研究的试剂和设备的详细信息列在 材料表中。 1. 全血制备 在室温下轻轻倒置 10 mL 全血管（包被乙二胺四乙酸 [EDTA]、酸-柠檬酸盐-葡萄糖 [ACD] 或肝素锂）10 次。 可选：如果要储存全血，请分装到冻存管中，在 -80 °C 下储存。 使用水平转子在 22 °C 下以 800 x g 离心试管 10 分钟，同时打开制动器（9 加速/9 减速）。 2. Buffy 外套系列 离心后，将样品放入生物安全柜中，检查三个不同的层（如图 1 所示）。注意：红细胞位于离心管的下部深红色层中。包含白细胞和血小板的白色不透明层位于 RBC 层上方，称为血沉棕黄层。顶部黄色层包含等离子体。 可选：如果要储存血浆，请将血浆分装到冻存管中，在 -80 °C 下储存。 从 10 mL 采血管中吸取 1 mL 血沉棕黄层（起始材料），然后转移到分别在步骤 3.1 和步骤 4.1 中指定和标记的试管中，用于手动和自动方法。使用移液器吸头旋转血沉棕黄层（白色不透明层），并通过吸出收集血沉棕黄层。注：抽吸过程中血浆和红细胞少于 100 μL 是可以接受的。如果为一名参与者收集了多支血管，则可以合并血沉棕黄层;但是，这可能会影响血小板浓度13。 对于手动处理，请继续执行第 3 部分。对于自动处理，请继续执行第 4 部分。 可选：如果要储存红细胞，请将红细胞分装到冻存管中，在 -80 °C 下储存。 3. PBMC 纯化 – 手动方法 注：每个磁体架最多可由一名操作员处理 8 个样品。 用字母 A-C 标记 3 x 5 mL 聚苯乙烯管。注：如果执行多个样品，即 1A、1B、1C、2A、2B、2C，请使用顺序编号。 将 60 μL 的 0.1 M EDTA（EDTA 终浓度为 6 mM，pH 值为 8.0，参见 配方补充文件 2 ）添加到包含步骤 2.3 中转移的血沉棕黄层的试管 A 中。 将 50 μL 鸡尾酒混合管（参见 材料表）添加到管 A 中，通过上下吹打至少 3 次混合，并在室温下孵育 5 分钟。 将 890 μL PBS 添加到试管 A 中，并通过上下吹打至少 3 次进行混合。 涡旋磁珠管（参见材料表）30 秒。 将 50 μL 磁珠添加到试管 A 中，并通过上下吹打至少 3 次进行混合。 立即将试管 A 放入磁架中，并在室温下孵育 5 分钟。 小心地将富集的细胞悬液移液到试管 B 中，收集不含/少量 （<100 μL） RBC 的透明组分，以实现最佳的 PBMC 回收率。注意：请勿打扰绑定到磁铁上的磁珠。建议使用移液管。 从磁铁架上取下管 A 并丢弃。 将 50 μL 磁珠添加到试管 B 中的细胞悬液中，并通过上下吹打至少 3 次混匀。 立即将试管 B 放入磁架中，并在室温下孵育 5 分钟。 小心地将富集的细胞悬液移液到管 C 中，仅收集透明组分。注意：请勿打扰绑定到磁铁上的磁珠。建议使用移液管。 从磁铁架上取下管 B 并丢弃。 立即将试管 C 放入磁架中，并在室温下孵育 5 分钟。 小心地将富集的细胞悬液移液到标记的离心管中，并用 PBS 加满至 2 mL。 将 50 μL 细胞悬液转移至自动细胞计数仪的样品杯中。对于 1：10 稀释的细胞计数，添加 450 μL PBS。继续第 5 节了解细胞计数步骤。 4. PBMC 纯化 – 自动化方法 注： 一台自动化 PBMC 仪器最多可处理 4 个样品。单个操作员可以并行运行多台仪器。 用字母 A 和 B 标记 2 x 14 mL 离心管，用字母 C 标记 1 x 50 mL 离心管，用“废液”标记 1 x 50 mL 离心管。注：在自动化 PBMC 仪器上每次运行只需要一个废液容器。如果执行多个样品，请使用 Sequences，即 1A、1B、1C、2A、2B、2C。 将 60 μL 的 0.1 M EDTA（最终 EDTA 浓度为 6 mM）添加到包含步骤 2.3 中转移的血沉棕黄层的试管 A 中。 涡旋磁珠管（参见材料表） 30 s。 通过打开仪器前部的电源来打开自动 PBMC 仪器。 在自动 PBMC 仪器主屏幕上，选择 Profile（ 配置文件 ）并选择所需的方案。注： EasySep Direct 人 PBMC 分离 19654 – 血沉棕黄层 是为此 PBMC 分离选择的方案配置文件。请参阅协议报告14 中此配置文件的制造商标准程序。 输入起始体积（吸入试管 A 中的血沉棕黄层量），并对每个样品重复上述步骤。 选择将使用相同试剂盒的所有象限。注：如果对多个象限使用相同的方案，自动 PBMC 仪器将建议对所有象限14 使用相同的试剂盒。 将带标签的耗材、滤光片吸头和缓冲液容器装入仪器的转盘中。包含磁珠管和混合物管的试剂盒将加载到象限 1 中。注：仪器将询问用户是否希望对所有象限使用 1 个试剂盒。选择“是”并使用试剂盒突出显示所有象限。 上样完成后，取下耗材和试剂的盖子，然后在仪器屏幕上选择运行。 运行完成后，从仪器转盘中选择 卸载 和取出样品（包含试管 C 中标记的 PBMC 悬浮液）。将磁珠管、混合物管和缓冲容器储存在 4 °C 下。 丢弃标记为 A、B 和废液的试管（参见步骤 4.1）和过滤吸头。注：自动化方法无需加注 PBS，因为 PBMC 悬浮液产生的最终体积为 7 mL。 将 500 μL 细胞转移到样品杯中，进行不稀释细胞计数。继续第 5 部分进行细胞计数。 5. 细胞计数 按照制造商的说明15 使用台盼蓝染料排除法进行细胞计数和活力。注：对于作者的内部过程，使用具有以下设置的自动细胞计数器进行细胞分析，以获取 PBMC。稀释因子 = 10（对于手动方案，如果细胞悬液体积较低）或 1（对于自动方案）细胞类型：PBMC浓度范围 = 5 x 104 至 1 x 107 个细胞/mL尺寸范围（直径）= 8 μm 至 50 μm图像数量 = 50 6. 冻存制备 在22°C下以300 x g 离心（使用摆动桶转子）样品管8分钟，同时打开制动器（9加速/ 9减速）。 离心后，将样品放回生物安全柜中。 使用移液管小心去除上清液。PBMC 沉淀可以留下少量上清液，以确保其不受干扰。 将沉淀重悬于 3 mL 冷冻存培养基中。缓慢而轻柔地上下混合悬浮液，直到均匀。注：Cyropreservation 培养基的体积可以根据所需的最终 PBMC 浓度进行调整。 将 1 mL 重悬的 PBMC 分配到预先分配的冻存管中，并将其置于控制速率冷冻容器中，在 -80 °C 下至少 4 小时。注意：等分到每个冷冻管的 PBMC 的体积可以根据研究者的偏好进行调整。 将冻存管在 -80 °C 下存放至少 4 小时后，将冻存管转移到液氮气相罐中进行长期储存。 7. 统计数据分析 使用 补充文件 3 中指定的统计和绘图软件分析代表性结果数据。