تعديل نضح لانجيندورف لأوقات التروية الممتدة لطعوم القلب القوارض
Summary
توضح هذه المقالة جدوى تحقيق أوقات نضح أطول (4 ساعات) من ترقيع قلب الفئران دون فقدان الوظيفة من خلال استخدام ضغوط نضح أقل (30-35 مم زئبق) من الفسيولوجية (60-80 مم زئبق) خلال لانجيندورف.
Abstract
على الرغم من التطورات الهامة في تشخيص وعلاج أمراض القلب والأوعية الدموية (CVDs) ، فإن المجال في حاجة ماسة إلى زيادة البحث والتقدم العلمي. ونتيجة لذلك، يمكن أن يوفر الابتكار و/أو التحسين و/أو إعادة استخدام مجموعة أدوات البحث المتاحة منصات اختبار محسنة للنهوض بالبحوث. التروية Langendorff هي تقنية بحثية قيمة للغاية في مجال أبحاث الأمراض القلبية الوعائية التي يمكن تعديلها لاستيعاب مجموعة واسعة من الاحتياجات التجريبية. يمكن تحقيق هذا الخياطة من خلال تخصيص عدد كبير من معلمات التروية ، بما في ذلك ضغط التروية ، والتدفق ، والتثطير ، ودرجة الحرارة ، وما إلى ذلك. يوضح هذا البروتوكول تعدد استخدامات نضح Langendorff وجدوى تحقيق أوقات نضح أطول (4 ساعات) دون فقدان وظيفة الكسب غير المشروع من خلال استخدام ضغوط نضح أقل (30-35 مم زئبق). إن تحقيق أوقات نضح ممتدة دون تلف الكسب غير المشروع و / أو فقدان الوظيفة الناجم عن التقنية نفسها لديه القدرة على إزالة العناصر المربكة من النتائج التجريبية. في الواقع ، في الظروف العلمية حيث تكون أوقات التروية الأطول ذات صلة بالاحتياجات التجريبية (أي العلاجات الدوائية ، وتحليل الاستجابة المناعية ، وتحرير الجينات ، والحفاظ على الكسب غير المشروع ، وما إلى ذلك) ، يمكن أن تكون ضغوط التروية المنخفضة مفتاحا للنجاح العلمي.
Introduction
شهد مجال أبحاث القلب والأوعية الدموية تطورات مهمة في تشخيص وعلاج أمراض القلب والأوعية الدموية (CVDs). ومع ذلك ، على الرغم من الانخفاض العام في معدلات الإصابة والوفيات ، لا تزال الأمراض القلبية الوعائية السبب الرئيسي للوفاة على مستوىالعالم 1,2. وتسلط هذه الحقيقة المقلقة الضوء على الحاجة إلى زيادة البحوث والتقدم العلمي، الذي يعتمد بلا شك على دقة أدوات البحث المتاحة وإمكانية التنبؤ بها. نتيجة لذلك ، هناك حاجة مستمرة للابتكار والتحسين و / أو إعادة تخصيص مجموعة أدوات البحث. على سبيل المثال ، يمكن تعديل نضح القلب إلى الوراء أو Langendorff ، وهي تقنية متاحة لهذا المجال لأكثر من قرن ، بسهولة لتغطية نطاق أوسع من الاحتياجات العلمية وتحقيق مجموعة أوسع من التطبيقات.
يوفر عزل الطعم القلبي عن بقية الكائن الحي أثناء نضح لانجيندورف درجة مهمة من التحكم في مجموعة واسعة من المعلمات التجريبية ، بما في ذلك درجة الحرارة ، والمحلول المتداول ، وضغوط التروية التاجية ، وما إلى ذلك 3،4،5،6،7. يسهل التلاعب بهذه المعلمات محاكاة عدد كبير من سيناريوهات القلب التي يمكن الاستفادة منها لمزيد من التقدم العلمي5،8،9،10. من بين هذه المعلمات ، من المحتمل أن يكون ضغط التروية هو الإعداد التجريبي الأكثرتجاهلا 11.
خلال Langendorff ، تظهر ضغوط التروية علاقة مباشرة مع معدل ضربات القلب ، وذروة الضغوط الانقباضية / الانبساطية ، واستهلاك الأكسجين11. يوفر هذا الارتباط تحكما مباشرا ودقيقا في مقدار العمل الذي تنتجه الطعوم القلبية ، والتي يمكن تعديلها لتلبية الاحتياجات التجريبية الفردية. على الرغم من قدرة التحكم القيمة هذه ، فقد انجذب المجال تاريخيا نحو استخدام ضغوط نضح أعلى (60-80 مم زئبق) ، مما يعرض جميع الطعوم القلبية لطلب عمل مرتفع بغض النظر عن الاحتياجات التجريبية8،12،13،14،15. تنشأ عواقب هذا الطلب المرتفع غير الضروري على العمل من المبدأ الشامل القائل بأن الإفراط في العمل يميل إلى أن يؤدي إلى الفشل المبكر. يبدو أن هذا ينطبق بشكل خاص على الطعوم القلبية التي يتم اختراقها عبر Langendorff ، حيث يبدو أن الطبيعة غير الفسيولوجية لهذه الطريقة ونقص دعم التعافي الموجود في الجسم الحي يؤدي إلى تفاقم فشل الكسب غير المشروع. هذا الفقدان المبكر لوظيفة الكسب غير المشروع يحد من التروية والأوقات التجريبية بشكل كبير. في الواقع ، في الظروف التي تكون فيها أوقات التروية الأطول أكثر صلة بالاحتياجات التجريبية (أي العلاجات الدوائية ، وتحليل الاستجابة المناعية ، وتحرير الجينات ، والحفاظ على الكسب غير المشروع ، وما إلى ذلك) ، يمكن توفير عمل القلب المنخفض مقابل زيادة متانة الكسب غير المشروع.
يوضح هذا البروتوكول جدوى استخدام ضغوط التروية المنخفضة (30-35 مم زئبق) خلال Langendorff ، بالإضافة إلى التأثير الكبير الذي تشكله هذه على وظيفة الكسب غير المشروع القلبي بمرور الوقت عند مقارنتها بضغوط التروية الأعلى (60-80 مم زئبق). علاوة على ذلك ، تسلط النتائج الواردة في هذه المخطوطة الضوء على أهمية إعطاء الأولوية لتخصيص مجموعة واسعة من معلمات التروية لتلبية الاحتياجات التجريبية بشكل أفضل.
Protocol
Representative Results
Discussion
إن نضح لانجيندورف هو تقنية مرنة للغاية تسمح بالخياطة والتعديل بشكل مثير للإعجاب لتلبية مجموعة واسعة من الاحتياجات التجريبية. يسمح بهذا الخياطة من خلال قابلية التعديل الكبيرة لمعظم معلمات التروية ، بما في ذلك ضغوط التروية. نظرا للطبيعة الرجعية ل Langendorff ، فإن ضغوط التروية تعادل ضغوط التروية التاجية ، والتي تلعب دورا أساسيا في وظيفة القلب. من المعروف أن ضغوط التروية التاجية (CPP) تتحكم بشكل مباشر في عمل القلب ، حيث أن مجموعة واسعة من مؤشرات القلب (أي ضغط البطين الأيسر ، والانقباض (dP /dt max) ، وتوتر الجدار ، وتصلب البطين) تتناسب طرديا مع CPP16،17،18. تاريخيا ، استخدم الحقل ضغوط التروية ، وفي الواقع CPP ، بين 60 مم زئبق و 80 مم زئبق في محاولة لتقليد الظروف الفسيولوجية5،8،15،19،20،21. ومع ذلك ، فإن الطبيعة غير الفسيولوجية للتروية الآلية خارج الجسم الحي إلى الوراء ، إلى جانب ارتفاع الطلب على العمل ، تؤدي إلى فقدان وظيفة القلب مع مرور الوقت (الشكل 3). بدلا من ذلك ، فإن انخفاض ضغوط التروية (30-35 مم زئبق) ، على الرغم من عدم تكرار الظروف الفسيولوجية لقلوب الفئران بدقة في الجسم الحي ، يقلل بطبيعته من الطلب على عمل القلب ويحقق أوقات نضح ممتدة (4 ساعات) دون فقدان الوظيفة مع مرور الوقت (الشكل 3) ، وانخفاض وذمة الكسب غير المشروع (الشكل 2C). يبدو أن استخدام ضغوط التروية المنخفضة ، على الرغم من أنه يدل على انحراف عن CPP الفسيولوجي ، يوفر مزايا مهمة على استخدام ضغوط التروية الفسيولوجية ، حيث أن القضاء على فقدان الوظيفة المعتمد على التقنية أثناء نضح Langendorff يحسن التقنية إلى نظام نموذجي أكثر دقة ويمكن التنبؤ به مع إمكانات كبيرة لتطوير أبحاث القلب والأوعية الدموية. على وجه الخصوص ، أصبحت مجالات البحث التي تفيد و / أو تتطلب أوقات نضح ممتدة للوصول إلى الأهمية العلمية (أي العلاجات الدوائية ، وتحليل الاستجابة المناعية ، وتحرير الجينات ، والحفاظ على الكسب غير المشروع الطبيعي ، وما إلى ذلك) ذات أهمية متزايدة في المعركة ضد الأمراض القلبية الوعائية.
نضح Langendorff هو بلا منازع أداة أساسية في مجال أبحاث القلب والأوعية الدموية. لذلك ، إلى جانب الفوائد الكبيرة التي تطرحها هذه التقنية العلمية على مجتمع البحث ، فإنها تأتي بمستوى مهم من التعقيد العلمي. في الواقع ، هناك العديد من الخطوات الحاسمة ضمن هذا البروتوكول التي تتطلب توحيدا دقيقا ، في المقام الأول لتجنب تلف الكسب غير المشروع القلبي قبل وأثناء وبعد بدء التروية مباشرة. الفرصة الأولى لتلف الكسب غير المشروع غير واضحة أثناء تدفق الوريد البابي. يهدف هذا التدفق بمحلول ملحي هيبارين إلى إزالة أكبر قدر ممكن من الدم الكامل من الطعم القلبي لغرض مزدوج. أولا ، إنه بمثابة وسيلة للقتل الرحيم عن طريق الاستنزاف. ثانيا ، يقلل من فرص التخثر داخل الكسب غير المشروع القلبي أثناء الاسترجاع والقنية والنقل ، حيث من المعروف أن دم الفئران الكامل له أوقات ملابس قصيرة للغاية22,23. ومع ذلك ، بعد المئات من عمليات التروية القلبية الناجحة ، أصبح من الواضح أن الضغط المطبق على كائن الفئران أثناء التنظيف له أهمية مطلقة ، حيث يبلغ ضغط التدفق المثالي حوالي 10 مم زئبق. يبدو أن ارتفاع ضغط تدفق الوريد البابي يؤدي إلى تلف الأوعية الدموية في الطعم القلبي ، مما يؤدي إلى زيادة مقاومة الأوعية الدموية (
). تؤدي المقاومة الوعائية العالية في الواقع إلى الوصول إلى ضغوط التروية المستهدفة بمعدلات تدفق أقل. يتم نقل هذا الخلل بين الضغط وتدفق الشريان التاجي في ضغط نبض البطين الأيسر المنتج (LVPP) ، مما يؤدي إلى تباين كبير.
المثال التالي لتلف الكسب غير المشروع القلبي المحتمل هو أثناء توصيل الكسب غير المشروع بالنظام عن طريق إدخال فقاعات الهواء في الشريان التاجي. يمكن إدخال فقاعات الهواء بسهولة عن طريق سوء التعامل مع القلب المقن (الشكل 1 ب) أو إزالة الفقاعات بشكل غير صحيح من نظام التروية في المنبع من مصيدة الفقاعات24. نظرا للطبيعة الرجعية لهذا الإعداد ، فإن أي إدخال للهواء سيؤدي إلى انسداد الهواء القلبي ، مما يؤدي إلى إهانات إقفارية ، ورجفان ، وموت الكسب غير المشروع بشكل شائع جدا. أخيرا ، تحدث الخطوة الحاسمة الأخيرة لضمان نجاح البروتوكول أثناء بدء التروية. بشكل مختلف عن الغالبية العظمى من المخطوطات التي تفيد باستخدام Langendorff كتقنية ، يتم بدء التروية في هذا البروتوكول عند تدفقات منخفضة نسبيا (1 مل / دقيقة) مع زيادات تدريجية (+0.2 مل / دقيقة) ، مما يضمن التحكم الكامل في ضغوط التروية5،8،15،19،20،21. هذه الزيادة التدريجية في التدفق ، وبالتالي الضغط ، أمر بالغ الأهمية لأن التغيرات المفاجئة في الضغط تزيد بشكل لا رجعة فيه من مقاومة الأوعية الدموية وتغير توازن التدفق / الضغط الدقيق.
تعتبر المقاومة الوعائية العالية في نضح لانجيندورف الذي يتم التحكم فيه بالضغط أمرا بالغ الأهمية ، حيث يتم الوصول إلى ضغوط التروية المستهدفة عند التدفقات المنخفضة ، وينتج عن الطعوم نقص في الأداء. من المحتمل أن يكون الاعتماد الكبير على هذا التوازن المثالي بين التدفق والضغط هو أكبر قيود هذا البروتوكول ، حيث أن أي ضرر سابق للكسب غير المشروع ، متعمد (أي الحفاظ على البرد الممتد ، وإهانة نقص التروية الدافئة ، واحتشاء عضلة القلب ، وما إلى ذلك) أو غير مقصود ، يؤدي إلى زيادة مقاومة الأوعية الدموية. في الواقع ، هذا البروتوكول مفيد بشكل خاص للبحث حيث تبدأ التجربة بعد بدء التروية (أي العلاجات الدوائية ، وتحليل الاستجابة المناعية ، وتحرير الجينات ، والحفاظ على الكسب غير المشروع الحراري ، وما إلى ذلك) ولكن ليس قبل ذلك. هذا القيد هو مثال ممتاز على أن Langendorff واحد لا يناسب جميع الأغراض ويجب توخي الحذر بشكل خاص لتكييف معلمات التروية لتلبية الاحتياجات التجريبية بشكل أفضل.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل بتمويل سخي ل S.N.T. من المعاهد الوطنية الأمريكية للصحة (K99 / R00 HL1431149; R01HL157803) وجمعية القلب الأمريكية (18CDA34110049). كما نعرب عن امتناننا للتمويل المقدم من المعهد الوطني الأمريكي للصحة (R01DK134590; R24OD034189) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم (EEC 1941543) ، وزمالة إليانور ومايلز شور في كلية الطب بجامعة هارفارد ، ومؤسسة عائلة بولسكي ، وجائزة كلافلين للباحث المتميز نيابة عن اللجنة التنفيذية للأبحاث التابعة ل MGH ، و Shriners Children’s Boston (Grant #BOS-85115).
Materials
| 5-0 Suture | Fine Scientific Tools | 18020-50 | |
| 14 G Angiocath | Becton Dickinson | 381867 | |
| 16 G Angiocath | Becton Dickinson | 381957 | |
| 24 mm Heart Chamber adaptors | Radnoti | 140132 | |
| Balloon Catheter | Radnoti | 170423 | |
| BD Slip Tip Sterile Syringes- 10 mL | Fisher Scientific | 14-823-16E | |
| BD Slip Tip Sterile Syringes- 1 mL | Fisher Scientific | 14-823-434 | |
| BD Slip Tip Sterile Syringes- 50 mL | Fisher Scientific | 14-820-11 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| Bubble Trap Compliance Chamber | Radnoti | 130149 | |
| Calcium Chloride | Sigma | C7902 | |
| Clamp Holder | United Scientic | RTCLMP1 | |
| Dextran | Sigma | 31389 | |
| DIN8 Extension Cable | Iworx | SKU C-DIN-EXT | |
| Falcon High Clarity 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| GSC Go Science Crazy Cast Iron Support Ring Stand | Fisher Scientific | S13748 | |
| Heart Chamber | Radnoti | 140160 | |
| Heated Water Circulator bath | Cole Parmer | N/A | |
| Heparin sodium Injection | Medplus | G-0409-2720-0409-2721 | |
| Hydrocortisone | Solu-Cortef | MGH Pharmacy | |
| Insulin | Humulin R | MGH Pharmacy | |
| Insvasive Fluid Filled Blood Pressure Sensor | Iworx | SKU BP-10x | |
| Iworx Data Acquisition System | Iworx | IX-RA-834 | |
| Krebs-Henseleit Buffer | Sigma | K3753 | |
| Left Ventricular Pressure Balloon | Radnoti | 170404 | |
| Masterflex L/S Easy-Load II Pump Head for Precision Tubing, PPS Housing, SS Rotor | VWR | MFLX77200-60 | |
| Masterflex L/S Standard Digital Pump Systems | VWR | MFLX07551-30 | |
| Membrane Oxygenating Chamber | Radnoti | 130144 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Polyethylene Tubing | Fisher Scientific | 14-170-12H | |
| Precision Pump Tubing-16 | VWR | MFLX96410-16 | |
| Sodium Bicarobonate | Sigma | 5761 | |
| Standard PHD ULTRA CP Syringe Pump | Harvard Aparatus | 88-3015 | |
| Tygon Transfer Tubing | VWR | MFLX95702-03 |
References
- Cardiovascular Diseases (cvds). World Health Organization Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cardiovascular-diseases-(cvds) (2021)
- Amini, M., Zayeri, F., Salehi, M. Trend analysis of cardiovascular disease mortality, incidence, and mortality-to-incidence ratio: Results from global burden of disease study 2017. BMC Public Health. 21 (1), 401 (2021).
- Aune, S. E., Yeh, S. T., Zelinski, D. P., Angelos, M. G. Measurement of hydrogen peroxide and oxidant stress in a recirculating whole blood-perfused rat heart model. Resuscitation. 82 (2), 222-227 (2011).
- Lateef, R., Al-Masri, A., Alyahya, A. Langendorff’s isolated perfused rat heart technique: A review. Int J Basic Clin Pharmacol. 4 (6), 1314-1322 (2015).
- Herr, D. J., Aune, S. E., Menick, D. R. Induction and assessment of ischemia-reperfusion injury in Langendorff-perfused rat hearts. J Vis Exp. (101), e52908 (2015).
- Vervoorn, M., et al. Extended normothermic ex situ heart perfusion without functional decline. J Heart Lung Transplant. 43 (4), S156 (2024).
- Moeslund, N., et al. Ex-situ oxygenated hypothermic machine perfusion in donation after circulatory death heart transplantation following either direct procurement or in-situ normothermic regional perfusion. J Heart Lung Transplant. 42 (6), 730-740 (2023).
- Testai, L., Martelli, A., Cristofaro, M., Breschi, M. C., Calderone, V. Cardioprotective effects of different flavonoids against myocardial ischaemia/reperfusion injury in Langendorff-perfused rat hearts. J Pharm Pharmacol. 65 (5), 750-756 (2013).
- Watanabe, M., Okada, T. Langendorff perfusion method as an ex vivo model to evaluate heart function in rats. Methods Mol Biol. 1816, 107-116 (2018).
- Chang, X., et al. Cardioprotective effects of salidroside on myocardial ischemia-reperfusion injury in coronary artery occlusion-induced rats and Langendorff-perfused rat hearts. Int J Cardiol. 215, 532-544 (2016).
- Neely, J. R., Liebermeister, H., Battersby, E. J., Morgan, H. E. Effect of pressure development on oxygen consumption by isolated rat heart. Am J Physiol. 212 (4), 804-814 (1967).
- Matsuura, H., et al. Positive inotropic effects of atp released via the maxi-anion channel in Langendorff-perfused mouse hearts subjected to ischemia-reperfusion. Front Cell Dev Biol. 9, 597997 (2021).
- Louradour, J., et al. Simultaneous assessment of mechanical and electrical function in Langendorff-perfused ex-vivo mouse hearts. Front Cardiovasc Med. 10, 1293032 (2023).
- Ueoka, A., et al. Testosterone does not shorten action potential duration in Langendorff-perfused rabbit ventricles. Heart Rhythm. 19 (11), 1864-1871 (2022).
- Reichelt, M. E., Willems, L., Hack, B. A., Peart, J. N., Headrick, J. P. Cardiac and coronary function in the Langendorff-perfused mouse heart model. Exp Physiol. 94 (1), 54-70 (2009).
- Abel, R. M., Reis, R. L. Effects of coronary blood flow and perfusion pressure on left ventricular contractility in dogs. Circ Res. 27 (6), 961-971 (1970).
- Arnold, G., Morgenstern, C., Lochner, W. The autoregulation of the heart work by the coronary perfusion pressure. Pflugers Arch. 321 (1), 34-55 (1970).
- Iwamoto, T., Bai, X. J., Downey, H. F. Coronary perfusion related changes in myocardial contractile force and systolic ventricular stiffness. Cardiovasc Res. 28 (9), 1331-1336 (1994).
- Rossello, X., Hall, A. R., Bell, R. M., Yellon, D. M. Characterization of the Langendorff perfused isolated mouse heart model of global ischemia-reperfusion injury: Impact of ischemia and reperfusion length on infarct size and LDH release. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 21 (3), 286-295 (2016).
- Headrick, J. P., Peart, J., Hack, B., Flood, A., Matherne, G. P. Functional properties and responses to ischaemia-reperfusion in Langendorff perfused mouse heart. Exp Physiol. 86 (6), 703-716 (2001).
- Noly, P. E., Naik, S., Tang, P., Lei, I. Assessment of ex vivo murine biventricular function in a Langendorff model. J Vis Exp. (190), e64384 (2022).
- Garcia-Manzano, A., Gonzalez-Llaven, J., Lemini, C., Rubio-Poo, C. Standardization of rat blood clotting tests with reagents used for humans. Proc West Pharmacol Soc. 44, 153-155 (2001).
- Lewis, J. H., Van Thiel, D. H., Hasiba, U., Spero, J. A., Gavaler, J. Comparative hematology and coagulation: Studies on rodentia (rats). Comp Biochem Physiol A Comp Physiol. 82 (1), 211-215 (1985).
- Motayagheni, N. Modified Langendorff technique for mouse heart cannulation: Improved heart quality and decreased risk of ischemia. MethodsX. 4, 508-512 (2017).
.