Modélisation avancée de l’anévrisme de l’aorte abdominale chez la souris par l’association de l’élastase topique et du ß-aminopropionitrile oral

Les protocoles pour les animaux sont approuvés par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université du Wisconsin-Madison (M005792). 1. Entretien des animaux Élevez des souris avec de la nourriture d’entretien standard. Utilisez des souris adultes ou de jeunes souris adultes (âgées de 8 à 12 semaines).REMARQUE : L’utilisation d’adultes permet de s’assurer que les animaux ont atteint leur pleine maturité et limite tout risque que les changements de diamètre aortique puissent être liés à la croissance de l’animal. Pour cette étude, nous avons utilisé des souris C57BL/6J mâles et femelles âgées de 22 à 24 semaines au moment de l’opération. Lu et ses collègues n’ont pas observé de différences significatives dans la réponse anévrysmale entre les souris plus jeunes et plus âgées8. De plus, alors que la plupart des modélisations d’anévrisme sont effectuées chez les souris mâles, ce modèle induit avec succès des AAA chez les souris mâles et femelles9. Déterminez la durée de l’étude et affectez les animaux à des groupes de traitement ou de simulation (témoins). Administrer de l’eau potable BAPN à 0,2 % aux souris du groupe de traitement et les soumettre à une intervention chirurgicale avec application topique d’élastase active dans l’aorte infrarénale. Administrer de l’eau non traitée aux animaux témoins et les soumettre à une intervention chirurgicale avec l’application d’élastase dénaturée sur l’aorte infrarénale. 2. Initiation à l’utilisation d’eau potable supplémentée en B-aminopropionitrile (BAPN) Deux jours avant la chirurgie, commencez le traitement des souris avec de l’eau potable BAPN à 0,2 %. Préparez de l’eau BAPN en plus grandes quantités et conservez-la dans l’obscurité à 4 °C jusqu’à 28 jours. Assurez-vous que l’eau BAPN atteint la température ambiante avant de la donner aux souris.REMARQUE : Nous recommandons que l’eau BAPN soit remplacée dans les cages tous les 7 jours pendant toute la durée de l’étude. 3. Préparation du matériel le jour de l’intervention Coupez les gants chirurgicaux en bandes de 5 mm x 10 mm, qui seront utilisées plus tard pour aider à isoler l’aorte avant le traitement à l’élastase. Préparez un champ chirurgical en découpant un ovale de ~ 1,5 cm x 3 cm au centre d’un champ chirurgical. Dépliez la gaze de 2 po x 2 po et coupez-la en deux pour créer des bandes de gaze d’environ 2,5 cm x 10 cm à utiliser plus tard pour la rétraction du contenu abdominal. Autoclave tous les instruments chirurgicaux (voir la Table des matières) et mise en place d’un champ opératoire stérile comme le montre l’exemple de la figure 1. Figure 1 : Exemple de configuration de chirurgie stérile en préparation du modèle murin d’AAA en élastase/BAPN. Abréviations : BAPN = ß-aminopropionitrile ; AAA = anévrisme de l’aorte abdominale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Préparez une cage de récupération postopératoire en plaçant une cage propre sous une lampe chauffante et placez une solution saline près de la lampe pour la réchauffer à la température corporelle (37 °C). Assurez-vous que la lampe chauffante est positionnée de manière à ce que la cage de récupération et le sérum physiologique soient chauds, mais ne dépassent pas 37 °C. Allumez la pompe à eau pour commencer à faire circuler de l’eau chaude à travers le coussin chauffant. 4. Préparation de l’animal pour la chirurgie Placez les souris dans une chambre d’induction et anesthésiez-les avec de l’isoflurane à 5 % à 200 ml/min à l’aide d’un vaporisateur électronique à faible débit. Pendant l’anesthésie, pesez chaque souris et administrez 0,6 mg/kg de buprénorphine ER et 20 mg/kg de carprofène par voie sous-cutanée pour l’analgésie. Utilisez des tondeuses à cheveux électriques pour couper la fourrure sur l’abdomen, du bas de l’abdomen à l’inférieur du processus xyphoïde. Utilisez de la gaze ou une lingette de laboratoire pour brosser l’excès de poils. Remettez les souris dans leur cage et attendez au moins 20 minutes pour que l’analgésie fasse effet avant de procéder à la chirurgie. Après au moins 20 minutes depuis l’administration de l’analgésie, placez la souris dans une chambre d’induction d’anesthésie et administrez à nouveau de l’isoflurane à 5 % à 200 ml/min à l’aide d’un vaporisateur électronique à faible débit jusqu’à ce que la souris soit sous sédation. Retirez la souris sous sédation de la chambre d’induction et placez-la en décubitus dorsal sur le champ opératoire. Appliquez du gel pour les yeux et fixez le cône nasal avec du ruban chirurgical. Réduire l’isoflurane inhalé à un taux de maintien de 1 à 2 % à 50 mL/min. Fixez les pattes avant et arrière de la souris avec du ruban chirurgical. Examinez le bas-ventre de la souris à la recherche de la vessie. Appliquez doucement une pression externe sur la vessie entre le pouce, l’index et le majeur pour induire la miction ; Pendant ce temps, utilisez un morceau de gaze pour évacuer l’urine.REMARQUE : Veillez à ne pas contaminer le champ opératoire. Commencez à désinfecter l’abdomen en appliquant un gommage à base d’iode ou de chlorhexidine et d’alcool à 70 % avec des cotons-tiges. Commencez au centre de l’abdomen et travaillez vers l’extérieur dans un mouvement circulaire 3x. Laissez la zone sécher brièvement entre les applications. Vérifiez s’il n’y a pas de réponse par pincement des orteils pour vous assurer que l’anesthésie est adéquate. Assurez-vous que le cône nasal et les membres sont bien fixés. Placez un champ chirurgical sur la souris, avec l’ouverture directement sur l’abdomen préparé chirurgicalement.REMARQUE : Ne faites pas glisser le rideau sur la souris pour éviter une contamination potentielle. 5. Induction chirurgicale de l’AAA Entrée dans la cavité abdominale :Lavez-vous les mains et portez des gants chirurgicaux propres en nitrile ou stériles. Avant d’entrer en contact avec le champ opératoire, vaporisez toujours des gants contenant 70 % d’EtOH et frottez les mains gantées ensemble jusqu’à ce qu’elles soient sèches. Utilisez une pince émoussée pour taper la peau dans la ligne médiane de l’abdomen. Utilisez des ciseaux chirurgicaux pour faire une petite entaille dans la peau, puis prolongez l’incision longitudinalement, d’environ 2 à 3 cm de longueur. Utilisez une pince pour soulever les muscles droits afin d’identifier la linea alba translucide. Utilisez des ciseaux pour pénétrer dans la cavité abdominale par la linea alba, puis étendez-la le long de la linea alba proximale et distale. Exposition de l’aorte abdominale :Humidifiez une bande de gaze et deux cotons-tiges avec une solution saline réchauffée. Créez un rouleau abdominal en roulant fermement une extrémité de la gaze à mi-chemin, en laissant une queue généreuse. Utilisez un écarteur cutané pour rétracter la paroi abdominale droite. À l’aide d’écouvillons humides à bout de coton, effectuez une rotation viscérale médiale droite en balayant doucement l’intestin grêle et le gros intestin vers le quadrant supérieur gauche et visualisez l’aorte et la veine cave inférieure (CVI). Utilisez un rouleau abdominal pour rétracter l’intestin hors de vue – rentrez l’extrémité roulée de la gaze sous l’intestin, puis amenez l’extrémité de la queue autour et hors du corps pour emmailloter doucement l’intestin. Appliquez une légère tension sur la queue de la gaze pour maintenir l’intestin hors du champ de vision. Ajustez le rouleau abdominal et l’écarteur cutané pour obtenir une vue optimale des organes rétropéritonéaux, comme le montre la figure 2A.REMARQUE : Le rouleau abdominal aide à garder l’intestin humide et à le protéger contre les dommages accidentels causés par des instruments chirurgicaux. Assurez-vous que la gaze reste humide pendant la procédure pour éviter que l’intestin ne se dessèche. Veillez à ne pas rétracter l’intestin avec force, car cela peut provoquer un pliage de l’artère mésentérique supérieure et un système vasculaire intestinal, ce qui peut potentiellement causer des lésions ischémiques. De plus, lors du balayage initial de l’intestin grêle, faites attention à une fine attache translucide entre le gros intestin et le foie inférieur (ligament hépatocolique), qui, si vous n’y prenez garde, peut facilement arracher la capsule hépatique et provoquer des saignements. S’il y a une tension sur ce ligament lors de la rétraction, divisez-le brusquement avec des ciseaux. Figure 2 : Représentation de la rétraction abdominale et vue chirurgicale optimale pour l’exposition de l’aorte infrarénale de la souris. (A) La mise en place d’un rouleau abdominal de gaze aide à rétracter les organes intra-abdominaux, tandis qu’un écarteur opposé aide à visualiser le rétropéritoine. Un champ chirurgical stérile (transparent pour montrer l’orientation de l’animal) est placé sur l’animal anesthésié pour aider à maintenir la stérilité. (B) Le fascia rétropéritonéal (boîte verte) recouvre l’aorte vers l’avant. (C) Exemple de l’aorte infrarénale après dissection du fascia rétropéritonéal. L’isolement de l’aorte par rapport à la VCI peut être réalisé en commençant par un espace potentiel entre l’aorte et la CIV situé juste distal par rapport à la veine rénale gauche lorsqu’elle traverse l’avant (cercle jaune). Abréviation : IVC = veine cave inférieure. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Dissection circonférentielle et isolement de l’aorte infrarénale :Confirmez que la VCI et l’aorte infrarénale sont bien visibles. Commencez à exposer l’aorte en entrant et en divisant d’abord le fascia rétropéritonéal (RP) (Figure 2B). Identifiez les artères gonadiques (testiculaires ou ovariennes) qui sont parallèles le long de l’aorte infrarénale antérieure (Figure 2B et Figure 3). À l’aide d’une pince, divisez brusquement le fascia entre les artères gonadiques et continuez longitudinalement pour exposer l’aorte vers l’avant (Figure 2C).REMARQUE : Le fascia RP est une fine couche translucide de tissu conjonctif qui contient des lymphatiques et le plexus splanchnique. Il est nécessaire de disséquer à travers le fascia RP pour exposer l’aorte. Cependant, ne disséquez pas à travers le tissu conjonctif de l’adventice aortique. Une déchirure de l’adventice (tissu conjonctif blanc) exposera le média (apparaît en rouge vif), et l’aorte se rompra probablement à cet endroit une fois que l’élastase sera appliquée. Ensuite, commencez à isoler l’aorte abdominale de la VC. Commencer cette dissection par un petit espace entre la VCI et l’aorte, situé juste en dessous du bord inférieur de la veine rénale gauche lorsqu’elle traverse l’aorte (Figure 2C). Utilisez les pointes des pinces pour écarter doucement les fibres du tissu conjonctif entre l’aorte et la VCI et continuez à travailler circonférentiellement autour de l’aorte à ce niveau.REMARQUE : La VCI est à paroi très mince et adhère étroitement à l’aorte par une fine couche de tissu conjonctif fibreux. Veillez à éviter autant que possible de manipuler l’IVC ou de le nettoyer. Disséquer d’abord le côté droit de l’aorte de la VCI (avant de disséquer le côté gauche de l’aorte de la musculature environnante) aidera l’aorte à « se détacher » de la VCI. Continuez à disséquer brusquement le plan entre l’aorte et la CVI, en travaillant caudalement vers la bifurcation aortique. Arrêter la dissection distale une fois que la bifurcation aortique a été atteinte.REMARQUE : Prenez des précautions supplémentaires lors de la dissection autour de l’artère mésentérique inférieure (IMA), qui est généralement située près de la section médiane de l’aorte infrarénale et se déplace latéralement à travers la VCI. Une fois que le bord droit de l’aorte est séparé de la VCI, retournez proximal au niveau de la veine rénale gauche. Disséquez le fascia RP du bord latéral gauche de l’aorte, en travaillant circonférentiellement autour jusqu’à ce que l’aorte soit complètement isolée. Voir la figure 3 pour l’anatomie pertinente de la dissection rétropéritonéale.REMARQUE : Soyez prudent lors de la dissection derrière l’aorte car il existe une grande variabilité dans l’emplacement et le nombre de veines et d’artères lombaires. Voir la figure 4 pour une référence des zones à haut risque de saignement avec cette dissection. Vérifiez soigneusement que l’aorte est isolée circonférentiellement de la VCI et de la musculature environnante autant que possible, avec une dissection minutieuse autour des segments aortiques attachés par l’IMA et les artères lombaires. Placez une bande de gant le long des bords droit et gauche de l’aorte, comme illustré à la figure 5A. Essayez de couvrir la plus grande partie possible de l’IVC. Utilisez des pieds à coulisse portatifs pour mesurer le diamètre aortique le plus large et enregistrez trois mesures. Vaporisez les pointes des étriers avec 70 % d’EtOH avant et après les mesures. Évitez de contacter directement l’aorte avec les pointes de l’étrier pour éviter la contamination.REMARQUE : Des photos à l’aide d’un microscope calibré compatible avec un appareil photo peuvent également être utilisées. Figure 3 : Anatomie de l’apport sanguin au bas-ventre, au bassin et au rétropéritoine de la souris. Abréviations : R = droite ; L = gauche. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 4 : Sites à haut risque de blessure et d’hémorragie lors de la dissection rétropéritonéale et de l’isolement circonférentiel de l’aorte infrarénale. Abréviations : L = gauche ; IMA = artère mésentérique inférieure. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 5 : Réponses peropératoires à l’application d’élastase ou au simulacre pendant le modèle AAA murin en élastase/BAPN. (A) Des segments de gant sont placés sur toute la longueur de l’aorte avant l’application d’élastase pour aider à protéger la VCI et l’intestin de l’exposition à l’élastase tout en gardant l’aorte imbibée d’élastase (B) L’application d’élastase dénaturée ne provoque pas de dilatation de l’aorte (boîte bleue). Le diamètre aortique maximal a été mesuré à 0,627 mm au départ, puis à 0,607 mm après 5 min d’élastase dénaturée topique. (C) L’application d’élastase provoque une dilatation de l’aorte après 5 min de traitement. Dans cet exemple, l’aorte (verte) s’est dilatée à 0,953 mm au lieu de 0,607 mm, soit une augmentation de 57 % du diamètre. Abréviations : BAPN = ß-aminopropionitrile ; AAA = anévrisme de l’aorte abdominale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Application de l’élastase :Utilisez un coton-tige pour tamponner tout excès de sang ou de liquide sur l’aorte. Ensuite, placez un morceau de gaze sèche de 10 mm x 2 mm sur l’aorte. À l’aide d’une pipette, distribuer 5 μL d’élastase (ou contrôler l’élastase dénaturée) pour saturer la gaze et l’aorte. Pliez délicatement les morceaux du gant autour de l’aorte.REMARQUE : Pour préparer de l’élastase dénaturée à utiliser dans des groupes fictifs ou témoins, faire bouillir l’élastase à 100 °C pendant 30 minutes. Attendre 5 min pour que l’élastase agisse sur l’aorte. Pendant cette période d’incubation, si nécessaire, relâchez une partie de la tension exercée par le rouleau abdominal et l’écarteur de peau.REMARQUE : En raison de l’effet de lot avec l’élastase, nous encourageons les chercheurs à utiliser la même bouteille d’élastase pour toutes les expériences d’une étude donnée. Avec chaque nouvelle bouteille d’élastase, nous recommandons d’effectuer une dose-réponse pour s’assurer qu’il n’y a pas un nombre écrasant de ruptures précoces (avant 4 semaines). La durée d’application de l’élastase peut également être ajustée entre 4 et 6 min en fonction de la réponse à l’élastase. Après 5 min, réinitialisez la rétraction intestinale et dépliez les morceaux du gant. Irriguez la cavité abdominale avec 1 ml de solution saline normale chaude stérile à 0,9 %, tout en retirant soigneusement la gaze et les morceaux de gant de l’aorte. Absorbez la solution saline dans l’abdomen avec de la gaze de 10 cm x 10 cm. Répéter l’irrigation de l’abdomen pour un total de 3 x 3 mL. Utilisez des pieds à coulisse portatifs pour mesurer à nouveau le diamètre aortique le plus large après l’application d’élastase et enregistrez 3x. Voir les figures 5B et C pour des exemples de dilatation de l’aorte au traitement par élastase fictive et active.REMARQUE : Les moyennes des trois mesures pré- et post-élastase peuvent être utilisées pour calculer le pourcentage de variation du diamètre aortique avec le traitement. En règle générale, il y a une dilatation notable de ~30 à 50 % immédiatement après le traitement à l’élastase, ce qui peut aider à garantir que l’élastase est fonctionnelle et que l’aorte a été traitée de manière adéquate. Le diamètre de l’aorte ne doit pas changer avec l’application d’élastase dénaturée ou peut être légèrement plus petit (probablement à cause d’un spasme). Fermeture de la cavité abdominale :Retirez délicatement le rouleau abdominal sous l’intestin et hors du corps. Si nécessaire, appliquez une solution saline supplémentaire sur l’intestin pour éviter de coller au rouleau abdominal lors du retrait. Assurez-vous que l’intestin est rose et correctement perfusé.REMARQUE : Il n’est pas nécessaire d’essayer de repositionner l’intestin à son emplacement d’origine ; tenter de le faire peut risquer une torsion de l’intestin ou des hernies internes. Rapprochez le fascia abdominal à l’aide d’une suture monofilament non résorbable 5-0. Fermez la peau avec 3-4 agrafes cutanées. 6. Soins postopératoires des animaux Placez la souris dans la cage de récupération à l’aide d’une lampe chauffante. Assurez-vous que la température de la cage est chaude et non chaude. Administrer un bolus de liquide sous-cutané de 0,5 à 1 mL de solution saline normale à 0,9 %. Laissez la souris se rétablir d’elle-même dans la cage chauffée pendant ~20 minutes jusqu’à ce qu’elle soit active conformément au protocole institutionnel, puis retournez dans une cage d’hébergement. Selon le protocole de l’établissement, administrer le carprofène 20 mg/kg 24 h après la chirurgie le jour 1 postopératoire et continuer quotidiennement pendant 3 jours. 7. Mesure de l’aorte et prélèvement tissulaire Après l’euthanasie avec isoflurane et une luxation cervicale, rouvrir la cavité abdominale. Prolongez l’incision à travers le sternum pour accéder au thorax. Exciser l’oreillette droite et perfuser le ventricule gauche avec 10 mL de solution froide de DPBS à 1 % pendant 2 min. Réséquer les poumons, le foie et la rate.REMARQUE : Veillez à ne pas blesser l’intestin ; Le déversement de contenu entérique peut avoir un impact sur l’analyse des tissus. Expliquez l’aorte abdominale et mesurez le diamètre maximal de l’aorte infrarénale, comme décrit ci-dessus. Continuez à disséquer l’ensemble de l’aorte et du cœur. Une fois le cœur et l’aorte isolés, coupez toutes les branches artérielles et les artères iliaques communes en laissant de courts segments intacts sur l’aorte. Placez le cœur et l’aorte sur un fond contrasté à côté d’une règle et d’une image. 8. Analyse des données et rapports Pour aider à tenir compte de l’erreur humaine, mesurez les diamètres de l’aorte au moins 3 fois chacun lorsque vous utilisez des pieds à coulisse portatifs, puis rapportez le diamètre comme valeur moyenne. Définir l’AAA comme une augmentation de 50 % du diamètre de l’aorte saine. Assurez-vous d’inclure à la fois les diamètres aortiques bruts et le pourcentage de changement de diamètre dans les résultats de l’étude.