Geavanceerde modellering van abdominale aorta-aneurysma's bij muizen door combinatie van topisch elastase en oraal ß-aminopropionitril
Summary
Dit protocol beschrijft een methodische chirurgische benadering voor het modelleren van geavanceerde abdominale aorta-aneurysma’s bij muizen door een combinatie van het rechtstreeks aanbrengen van elastase op de infrarenale aorta en het toedienen van ß-aminopropionitril via drinkwater.
Abstract
Het topische elastase-muizenmodel van abdominaal aorta-aneurysma (AAA) wordt verbeterd wanneer het wordt gecombineerd met met ß-aminopropionitril (BAPN) aangevuld drinkwater om op betrouwbare wijze echte infrarenale aneurysma’s te produceren met gedrag dat menselijke AAA’s nabootst. Het plaatselijk aanbrengen van elastase op de adventitia van de infrarenale aorta veroorzaakt structurele schade aan de elastische lagen van de aortawand en initieert aneurysmale dilatatie. Gelijktijdige toediening van BAPN, een lysyloxidaseremmer, bevordert aanhoudende wanddegeneratie door crosslinking van collageen en elastine te verminderen. Deze combinatie resulteert in grote AAA’s die geleidelijk uitzetten, intraluminale trombus vormen en kunnen scheuren. Het verfijnen van chirurgische technieken, zoals het omtrekselijk isoleren van het gehele infrarenale aortasegment, kan helpen de procedure te standaardiseren voor een consistente en grondige toepassing van varkenspancreaselastase, ondanks verschillende operators en anatomische variaties tussen muizen. Daarom is het elastase/BAPN-model een verfijnde benadering voor het chirurgisch induceren van AAA bij muizen, die menselijke aneurysma’s beter kan recapituleren en extra mogelijkheden biedt om de groei van aneurysma’s en het risico op scheuren te bestuderen.
Introduction
Een aneurysma wordt gedefinieerd als een pathologische verwijding van een bloedvat van meer dan 50% van de gezonde vaatdiameter1. Ondanks dat abdominale aorta-aneurysma’s (AAA) een veel voorkomende aandoening zijn bij de vergrijzende bevolking, met een incidentie van ongeveer >5% van de mannen > de leeftijd van 65 jaar, zijn er geen gerichte therapeutische strategieën voor de behandeling van AAA1. De huidige behandeling van AAA is beperkt tot het verminderen van risicofactoren en chirurgisch herstel met open of endovasculaire chirurgie op basis van aortadiameter of groeisnelheid2. Het grootste gevaar van AAA is een aneurysmaruptuur, die dodelijk is als het niet wordt behandeld, en reparatie in deze opkomende omgeving kan sterfterisico’s van meer dan 90% met zich meebrengen1.
De pathofysiologie van AAA is gecompliceerd, multifactorieel en niet volledig begrepen3. Kenmerken van menselijke AAA zijn onder meer echte aneurysmale dilatatie van de aortawand met een infiltratie van ontstekingscellen, de aanwezigheid van intraluminale trombus en progressieve dilatatie die leidt tot uiteindelijke ruptuur 3,4. Bovendien worden AAA’s geassocieerd met een hoge leeftijd, hebben ze een 9:1 man:vrouw geslachtsoverwicht en komen ze meestal voor in de infrarenale aorta5. Het modelleren van alle kenmerken en gedragingen van menselijke AAA’s bij dieren blijft een voortdurende uitdaging6.
De huidige AAA-modellering wordt voornamelijk uitgevoerd bij muizen en aneurysma’s worden vaak geïnduceerd met behulp van een van de drie methoden: door angiotensine II (AngII) infusie via een subcutaan geïmplanteerde osmotische pomp en door directe toepassing van calciumchloride (CaCl2) of elastase op de aorta7. Bij de laatste methode wordt varkenspancreaselastase (PPE) aangebracht op een segment van de infrarenale aorta en veroorzaakt enzymatische afbraak van elastinevezels in de elastische lamel van de tunica media. Deze structurele schade resulteert in de verzwakking van de aortawand en naar buiten gerichte aneurysmale dilatatie. Het gebruik van topische elastase alleen produceert echter relatief kleine infrarenale aneurysma’s, die in de loop van de tijd niet geleidelijk groter worden of scheuren. Meer recentelijk verbeterden Lu et al. dit model door extra β-aminopropionitril (BAPN), een onomkeerbare remmer van lysyloxidase, toe te dienen aan hun met elastase behandelde muizen8. Door de verknoping van elastine- en collageenvezels te voorkomen, zorgt BAPN-suppletie ervoor dat door elastase beschadigde aorta’s geleidelijk verwijden tot het punt van scheuren. Het elastase/BAPN-model heeft bovendien een hogere incidentie van AAA dan het topische elastasemodel, en de geproduceerde aneurysma’s zijn ook groter en bevatten intraluminale trombus8.
In het elastase/BAPN-model kan de mate van chirurgische dissectie en blootstelling van de aorta aan elastase van invloed zijn op het succes en de reproduceerbaarheid van dit model. In dit manuscript beschrijven we dat gelijktijdige toediening van BAPN-drinkwater en topische toediening van elastase op de aorta na omtreksisolatie van het gehele infrarenale aortasegment de reproduceerbaarheid verbetert, rekening houdt met anatomische verschillen tussen dieren en resulteert in een grotere AAA-inductiesnelheid, aneurysmagroottes en ruptuurincidentie. In dit artikel beschrijven we een gestandaardiseerde aanpak voor het betrouwbaar induceren van geavanceerde abdominale aorta-aneurysma’s bij muizen met behulp van een combinatie van topisch elastase en BAPN-aangevuld water.
Protocol
Representative Results
Discussion
Inzicht in de complexe pathofysiologie van AAA is van cruciaal belang voor het verbeteren van de behandeling van aorta-aneurysma-aandoeningen. Hoewel er actief nieuwere strategieën worden ontwikkeld om de chirurgische resultaten te verbeteren, blijven AAA’s wijdverbreid in onze vergrijzende samenleving en blijft aneurysmaruptuur een belangrijke doodsoorzaak in de Verenigde Staten10. Daarom rechtvaardigen de onvervulde behoeften op het gebied van AAA-detectie-, preventie- en behandelingsstrategieën verder fundamenteel onderzoek naar aneurysma’s11.
Diermodellen die de kenmerken en het gedrag van menselijke AAA’s nauwkeurig en efficiënt samenvatten, zijn essentieel voor mechanistische studies van de pathofysiologie van aneurysma’s en het identificeren van potentiële therapeutische doelen. Hoewel de huidige diermodellen de belangrijkste aspecten van de aneurysmale veranderingen die optreden bij menselijke ziekten kunnen nabootsen, vertegenwoordigt geen enkel model volledig de ware complexiteit van menselijke AAA’s. Momenteel zijn muizen de meest geaccepteerde soort voor AAA-modellering bij dieren. Onderzoekers moeten rekening houden met de verschillende sterke en zwakke punten van elk muizenmodel voor hun specifieke aneurysma-onderzoek, zoals die vakkundig worden beschreven in beoordelingen van Daugherty et al. en Busch et al.12,13.
Het gebruik van elastase om AAA bij knaagdieren te induceren werd voor het eerst beschreven door Anidjar et al. in 199014. Perfusie van de aorta met varkenspancreaselastase met behulp van een spuitpomp zorgt voor een initiële dilatatie tussen ongeveer 50% en 70%, en de verwijde segmenten vertonen gunstig vergelijkbare pathologische kenmerken van menselijke AAA’s, zoals mediale degeneratie en adventitiële ontsteking. Het klassieke perfusiemodel is echter misschien wel het technisch meest uitdagende aneurysmamodel, en de aneurysma’s die doorgaans in de tweede week worden gevormd, beginnen daarna geleidelijk te verdwijnen. Bhamidipati et al. in 2012 toonden vervolgens aan dat adventitiële toepassing van elastase ook met succes vergelijkbare aneurysma’s zou kunnen induceren die beter reproduceerbaar zijn in maat15. Een veel minder uitdagend model, het topische elastasemodel, werd op grote schaal toegepast in onderzoek naar aneurysma’s. Aanvullende methodologie en voordelen van het topische elastasemodel worden besproken in de methodenpaper van Xue en collega’s16.
Het elastase/BAPN-model van muizen AAA werd in 2017 ontwikkeld door Lu en collega’s8. De introductie van 0,2% BAPN-drinkwater verbeterde veel van de kritieken op het klassieke topische elastasemodel, dat nu aneurysma’s produceert die voortdurend uitzetten tot het punt van AAA-ruptuur. In hun studie uit 2017 toonden ze aan dat muizen in de met elastase / BAPN behandelde groep significant hogere AAA-vormingssnelheden hadden in vergelijking met de elastasegroep (93% versus 65%, P 800% basislijndiameter en vormden ze intraluminale trombus (53,8%) en 46,2% scheurde spontaan voor het einde van het experiment. Dit model heeft onderzoekers in staat gesteld om factoren te onderzoeken die van invloed kunnen zijn op de progressie en stabiliteit van het aneurysma in de loop van de tijd.
Berman et al. onderzochten het elastase/BAPN-model verder door de concentratie van topisch elastase, de duur van het onderzoek, de timing van BAPN-toediening en de impact vandiergeslacht te variëren. Behandeling met 5 μl hoger geconcentreerd elastase (5 mg/ml of 10 mg/ml) produceerde grotere aneurysma’s dan 2,5 mg/ml gedurende 56 dagen. De prevalentie van intraluminale trombusvorming hing ook af van de elastaseconcentratie, die optrad bij 28,6% van de met 5 mg/ml behandelde muizen en 62,5% van de met 10 mg/ml behandelde muizen. Ze toonden ook aan dat het elastase/BAPN-model aneurysma’s bij vrouwelijke muizen kan induceren. Hoewel slechts een paar vrouwelijke muizen werden bestudeerd (n=5), ontdekten ze dat de aneurysma’s bij vrouwtjes vatbaarder waren voor scheuren (2 van de 5 muizen) en significant groter waren dan mannelijke AAA’s na 56 dagen.
In dit artikel willen we een methode bieden om een van de grootste beperkingen van chirurgische modellering aan te pakken, namelijk de variatie in de chirurgische procedure. Zonder een duidelijke consensus over de mate van dissectie en het gebied van de aorta dat met elastase is behandeld, kunnen de resultaten van dit model sterk variëren tussen dieren, onderzoekers en instellingen. We hebben talloze anatomische variaties tussen muizen waargenomen, waaronder het aantal en de grootte van lumbale slagaders en aders, en de locatie van de IMA, het opstijgen van de linker gonadale ader, onder andere, wat beperkend kan zijn bij het behandelen van slechts een deel of een specifiek segment van de infrarenale aorta. Hier tonen we aan dat het circumferentieel ontleden van de gehele lengte van de infrarenale aorta van de linker nierslagader proximaal tot de aorta-bifurcatie distaal helpt om reproduceerbare graden van blootstelling aan de aorta te bieden, ondanks anatomische verschillen, terwijl het succes van aneurysma-inductie wordt vergroot en duidelijke grenzen worden gesteld aan de operator. Bovendien heeft de grootte en de meer anterieure positie van de IVC de neiging om het grootste deel van de aorta te bedekken, wat van invloed kan zijn op de hoeveelheid behandelde aorta als deze niet wordt geïsoleerd van de IVC. Hoewel het noodzakelijk is om de retroperitoneale fascia te verwijderen om de aorta bloot te leggen, is het belangrijk om het bindweefsel van de adventitia niet volledig van de aorta te ontleden en een van de medialagen bloot te leggen, omdat dit meestal resulteert in ruptuur tijdens de elastase-incubatieperiode van 5 minuten. Dit zou kunnen dienen als een extra interne controle in de mate van de dissectie met dit model, maar kan een frustrerende leercurve zijn bij het toepassen van dit model. Operators zullen bovendien gebieden met een hoger risico leren (Figuur 4) die gemakkelijk tijdens de operatie gewond kunnen raken en tot oncontroleerbare bloedingen kunnen leiden.
Hoewel het belangrijk is dat de procedurele stappen van dit model consistent zijn, kan de duur van het onderzoek en de timing van intervalechografie variëren, afhankelijk van het doel van het onderzoek. Aortadilatatie begint onmiddellijk met het aanbrengen van elastase, maar studies met dit model volgen muizen gewoonlijk gedurende 28 dagen na de operatie7, zoals in dit voorbeeldexperiment. Verlenging van de studieduur moet worden overwogen bij het bestuderen van gevorderde AAA’s, groei op lange termijn, intraluminale trombusvorming of ruptuur.
Aanvullende perioperatieve maatregelen, zoals het handhaven van de lichaamstemperatuur en hydratatiestatus van het dier, kunnen helpen om de overleving van het dier van deze invasieve procedure te verbeteren. Het gebruik van een verwarmingskussen tijdens de operatie en plaatsing in een warme herstelkooi kan onderkoeling helpen voorkomen. Zoutoplossing moet worden opgewarmd voordat het wordt gebruikt om de buikholte te irrigeren. Een onderhuidse vloeistofbolus direct na de operatie kan ongevoelige vochtverliezen tijdens de operatie verklaren en het dier helpen voldoende hydratatie te behouden tijdens de onmiddellijke herstelfase. Met een zorgvuldige weefselbehandeling en een consistente methodische aanpak kan het elastase/BAPN-model door een ervaren operator tussen 30 minuten en 45 minuten per muis worden uitgevoerd en op betrouwbare wijze AAA produceren met zeer lage perioperatieve complicaties.
Onze resultaten tonen aan dat de combinatie van BAPN in combinatie met circumferentiële dissectie van de infrarenale aorta voorafgaand aan het aanbrengen van elastase grote, continu expanderende AAA’s produceert, met grotere diameters en ruptuurincidentie bij kortere perioden. In dit experiment werden AAA’s met succes geïnduceerd bij alle mannelijke (6 van de 6) en vrouwelijke (6 van de 6) muizen die werden behandeld met actief elastase. Blootstelling aan elastase gedurende 5 minuten resulteerde in een onmiddellijke toename van de aortadiameter met ongeveer 30-40%, wat nuttig is bij het bevestigen van een succesvolle en consistente toepassing van elastase onder behandelingsgroepen. Net als Berman et al. hebben we aangetoond dat dit model AAA’s kan induceren bij vrouwelijke muizen, die ook een grotere ruptuurrespons hebben dan mannetjes. De helft van de vrouwelijke muizen (3 van de 6) scheurde binnen 28 dagen, vergeleken met 0 van de 6 mannetjes, maar vrouwelijke muizen wegen minder dan mannetjes. Mannelijke muizen vertoonden een toename van de AAA-diameter met 257% vergeleken met -4% van de mannelijke controles, terwijl de overlevende vrouwtjes een toename van de diameter van 417% vertoonden, vergeleken met -16% van de vrouwelijke controles. De diameters van de aorta verschilden niet significant tussen de overlevende mannelijke en vrouwelijke behandelde muizen na 28 dagen vanwege het hogere aantal rupturen in de vrouwelijke groep. We speculeren dat de nepmuizen tegen het einde van het onderzoek kleinere aortadiameters vertonen, omdat de aorta de neiging heeft om tijdens de eerste dissectie licht te verwijden en vervolgens na 28 dagen littekenweefsel vormt.
Het elastase/BAPN-model heeft bepaalde beperkingen. Circumferentiële dissectie van de aorta vereist fijne chirurgische vaardigheden, maar helpt de reproduceerbaarheid en de mate van aneurysma-inductie te verbeteren. Net als bij het topische elastasemodel is er ook een batch-effect in de activiteit van het elastase-enzym, wat, zoals eerder vermeld, daarom belangrijk is om in een bepaald experiment voor alle dieren dezelfde fles elastase te gebruiken. Hoewel de incidentie van AAA intraluminale trombus en ruptuur toeneemt met de tijd en de ernst van het aneurysma, zijn deze in dit model niet gegarandeerd of volledig voorspelbaar.
Samenvattend produceert het elastase/BAPN-model grote, echte infrarenale AAA’s bij zowel mannelijke als vrouwelijke muizen, die in de loop van de tijd geleidelijk uitzetten, intraluminale trombus vormen en in staat zijn om te scheuren. Deze sterke punten van dit muizenmodel helpen om sommige gedragingen en kenmerken van aneurysma’s bij mensen beter samen te vatten. Hoewel technisch moeilijk, kan een zorgvuldige en grondige dissectie van de aorta de aneurysmale respons versterken. Momenteel is de elastase/BAPN-methode een geavanceerd model voor het bestuderen van infrarenale abdominale aorta-aneurysma’s.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd ondersteund door het National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) van de National Institutes of Health (NIH) onder 1R01HL149404-01A1 (BL), en de Ruth L. Kirschstein National Research Service Award T32 HL 007936 aan het University of Wisconsin-Madison Cardiovascular Research Center (JB). Figuren werden gemaakt of bewerkt met Biorender.com. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van GraphPad Prism 10-software.
Materials
| 0.5 L induction chamber | Kent Scientific Corporation | SOMNO-0530XXS | anesthesia induction chamber |
| 0.9% sodicum chloride injection, USP, 20 mL | Hospira | NDC 0409-4888-03 | normal saline |
| 3 mL syringe Luer-Lok Tip with BD PrecisionGlide Needle 22 G x 3/4 | BD | REF 309569 | syringe, 22 G needle |
| 3-Aminopropionitrile Fumarate | TCI | A0796 | BAPN |
| 3-Aminopropionitrile Fumarate salt | Sigma-Aldrich | A3134-25G | BAPN |
| Avant Delux gauze sponges, 2" x 2" 4-Ply | Medline | NON26224 | gauze sponges |
| Balding clipper | Whal Clipper Corporation | 8110 | hair clippers |
| betadine surgical scrub (povidone-iodine, 7.5%) | Avrio | NCD 67618-154-16 | betadine surgical scrub |
| blunt forceps | ROBOZ | RS-5130 | blunt forceps |
| Buprenorphine ER-lab | ZooPharm | BERLAB0.5 | buprenorphine |
| carprofen | Norbrook | NDC 55529-131-11 | carprofen |
| CASTROVIEJO 5.75" straight with lock | ROBOZ | RS-6412 | Castroviejo needle driver |
| cotton tipped wood applicators, 6" | Dynarex | No. 4302 | cotton tipped wood applicators |
| DESMARRES 5.5' rectractor | ROBOZ | RS-6672 | skin rectractor |
| digital caliper, 0-150 mm | World Precision Instruments | 501601 | digital caliper |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-144 | DPBS |
| Elastase from porcine pancrease Type I | Sigma-Aldrich | E1250-10MG | elastase >4.0 units/mg protein |
| Ethanol 200 proof | Decon Labs, Inc | 2701 | ethanol diluted to 70% |
| eye lube | Optixcare | 14716 | eye lube |
| Germinator 500 dry sterilizer | CellPoint Scientific, Inc | 5-1450 | dry bead sterilizer |
| heat therapy mat | Adroit Medical Systems | V016 | heat therapy mat |
| heat therapy pump | Adroit Medical Systems | HTP-1500 | heat therapy pump |
| isoflurane, USP | Akorn Animal Health | NCD 59399-106-01 | isoflurane |
| L-10 pipette | Rainin | LTS 0.5-10 uL | pipette |
| Low profile anesthesia mask, small | Kent Scientific Corporation | SOMNO-0801 | anesthesia nose cone |
| micro dissector scissors | ROBOZ | RS-5619 | micro dissector scissors |
| microscope | Leica | S9i | microscope |
| Nii-LED high intensity LED illuminatorLED exertnal light | Nikon Instruments, Inc | 83359 NII-LED | external dissection light |
| nylon 5-0 monofilament, black non-absorbable suture | Oasis | MV-661-V | 5-0 nylon suture |
| polyisoprene surgical gloves, GAMMEX Non-Latex PI Micro, size 7.5 | Ansell | 20685975 | non-latex surgical gloves |
| Reflex 7 mm stainless steel wound clips | CellPoint Scientific, Inc | 203-1000 | wound clips |
| scale | Ohaus | Compass CR2200 | scale |
| SomnofFlo Accessory Kit | Kent Scientific Corporation | 10-8000-71 | tubing for electronic vaporizer |
| SomnoFlo electronic vaporizer | Kent Scientific Corporation | SF2992 | low-flow electronic vaporizer |
| SomnoPath Flow Diverter | Kent Scientific Corporation | SP1016 | flow diverter for electronic vaporizer |
| SS/45 sharp forceps | ROBOZ | RS-4941 | sharp forceps |
| surgical scissors | ROBOZ | RS-6010SC | surgical scissors |
| vessel forceps | Dumont | VES 0.35 | vessel forceps |
References
- Kent, K. C. Clinical practice. Abdominal aortic aneurysms. New Engl J Med. 371 (22), 2101-2208 (2014).
- Wanhainen, A., et al. European Society for Vascular Surgery Guidelines on the management of aorto-iliac abdominal aortic aneurysms. Eur J Vasc Endocasc Surg. 57 (1), 8-93 (2019).
- Shimizu, K., Mitchell, R. N., Libby, P. Inflammation and cellular immune responses in abdominal aortic aneurysms. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26 (5), 987-994 (2006).
- Shen, Y. H., et al. Aortic aneurysms and dissections series. ArteriosclerThromb Vasc Biol. 40 (3), e37-e46 (2020).
- Stanley, J. C., Veith, F., Wakefield, T. W. . Current Therapy in Vascular and Endovascular Surgery E-Book. , (2014).
- Morgan, S., et al. Identifying novel mechanisms of abdominal aortic aneurysm via unbiased proteomics and systems biology. Front Cardiovasc Med. 9, 889994 (2022).
- Yin, L., Kent, E. W., Wang, B. Progress in murine models of ruptured abdominal aortic aneurysm. Front Cardiovasc Med. 9, 950018 (2022).
- Lu, G., et al. A novel chronic advanced stage abdominal aortic aneurysm murine model. J Vasc Surg. 66 (1), 232-242.e4 (2017).
- Berman, A. G., et al. Experimental aortic aneurysm severity and growth depend on topical elastase concentration and lysyl oxidase inhibition. Sci Rep. 12 (1), 99 (2022).
- . Disease Control and Prevention Deaths, percent of total deaths, and death rates for the 15 leading causes of death in 5-year age groups, by race, and sex Available from: https://www.cdc.gov/nchs/nvss/mortality/lcwk1.htm (2015)
- Dansey, K. D., et al. Epidemiology of endovascular and open repair for abdominal aortic aneurysms in the United States from 2004 to 2015 and implications for screening. J Vasc Surg. 74 (2), 414-424 (2021).
- Daugherty, A., Cassis, L. A. Mouse models of abdominal aortic aneurysms. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 (3), 429-434 (2004).
- Busch, A., et al. Translating mouse models of abdominal aortic aneurysm to the translational needs of vascular surgery. JVS Vasc Sci. 2, 219-234 (2021).
- Anidjar, S., et al. Elastase-induced experimental aneurysms in rats. Circulation. 82 (3), 973-981 (1990).
- Bhamidipati, C. M., et al. Development of a novel murine model of aortic aneurysms using peri-adventitial elastase. Surgery. 152 (2), 238-246 (2012).
- Xue, C., Zhao, G., Zhao, Y., Chen, Y. E., Zhang, J. Mouse abdominal aortic aneurysm model induced by perivascular application of elastase. J Vis Exp. (180), 63608 (2022).
.